冷却肉中致病菌的多重PCR检测技术研究

摘要

沙门氏菌(Salmonella)、大肠O157：H7(Escherichia coli O157：H7)和单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes简称L.M)是3种典型的人畜共患致病菌，在各类食品中，对冷却肉的污染最为严重，人食用后可出现不同程度的恶心、呕吐，死亡率高达30％左右。目前，对致病菌的检测主要采用的是增菌培养、平板分离、生物化学筛选和血清学鉴定的常规方法，一般要4～7天才能出结果，费时费力。后来发展起来的免疫学方法，虽然简单、快速，但却容易出现假阳性或假阴性现象。 本文以上述3种菌为研究对象，应用Primer 5和Oligo引物设计和分析软件，分别针对沙门氏菌编码DNA结合蛋白的hns基因、大肠O157：H7编码外膜蛋白紧密素的eaeA基因和单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因Hly设计3对特异性引物，建立了同步检测肉制品中3种致病菌的多重PCR方法。在引物特异性分析实验中，三对引物与各自对应的目标菌结合，分别扩增出大小为530bp、420bp、270bp左右的条带，与预期的片段大小一致，而与其它非目标菌之间没有非特异性扩增现象，证明引物具有很高的特异性。同时，这三对引物是根据致病菌的毒力因子设计的，运用PCR方法检测与疾病相关的毒素基因有助于对疾病发病机理的了解。 通过比较酚/氯仿法和煮沸法提取DNA的效果，发现对于低剂量感染的细菌，酚/氯仿法提取的DNA质量更好，PCR扩增条带更亮。后种方法虽然速度快，但是没有专门的除蛋白质和RNA等步骤，所得到的DNA模板量少，纯度也不够高。 本文通过对多重PCR反应中退火温度、退火时间、引物浓度、M2+浓度和PCR反应循环数的优化。所建立的多重PCR方法具有极高的特异性，能在5～6h(除去增菌时间)内完成对三种菌的同时检测，比常规的细菌诊断学方法更加快速、准确和简便。而且当满足优化后的PCR反应体系(1.25 U Taq酶；200μmol/L dNTP；2mM MgCL2:10×PCR buffer2.5μl；1.5μM/每对引物：总体积为25μl)和反应条件(94℃预变性5min后进入循环，94℃1min：56.5℃45sec；72℃1min；共循环30个反应；72℃延伸10min；4℃保存)时，冷却肉中混菌检测灵敏度可达到2.3× 102cfu/mL，低于单重PCR的灵敏度5.3～7 cfu/mL，但高于文献中致病菌的感染剂量103 cfu/mL，对致病菌的监测有较大的应用价值。 在与mini-VIDAS仪器法的对比实验中，选用了mini-VIDAS仪器法检测为沙门氏菌阳性的鸡骨素样品，结果该研究建立的多重PCR方法检测结果为沙门氏菌阴性，与国标法GB/T4789.4-2003检测结果一致。说明mini-VIDAS仪器法虽然检测速度更快(45min)，但却容易出现假阳性结果，较之多重PCR方法的特异性略低。 用本文建立的多重PCR方法对漯河双汇的冷却肉进行检测，多次检测结果表明，该方法对冷却肉中存在的沙门氏菌、大肠O157：H7和单核细胞增生李斯特氏菌具有很好的特异性。经过进一步的研究和优化，对其它致病菌的检测也将会有很大的应用价值。

目录

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致谢

摘要

1文献综述

1.1食品安全现状

1.2动物性食品安全问题

1.2.1化学性污染

1.2.2放射性污染

1.2.3生物性污染

1.3冷却肉中三种主要的致病菌

1.3.1沙门氏菌

1.3.2大肠杆菌O157：H7

1.3.3单细胞增多症李氏菌

1.4致病微生物快速检测技术的研究现状

1.4.1常规的致病微生物的检测技术

1.4.2以免疫学方法建立的快速检测技术

1.4.3分子生物学技术在快速检测病原微生物的研究进展

1.5多重聚合酶链反应

1.5.1多重PCR的原理及其特点

1.5.2多重PCR技术的影响因素

1.5.3多重PCR技术在食品致病菌检测中的研究进展

1.5.4多重PCR的最新进展

2引言

3材料和方法

3.1材料

3.1.1实验所用菌株

3.1.2试剂

3.1.3仪器

3.2方法

3.2.1引物设计

3.2.2增菌培养

3.2.3模板的提取

3.2.4 PCR反应体系及条件

3.2.5 PCR产物检测

3.2.6凝胶成像分析

3.2.7单重PCR检测

3.2.8多重PCR检测

3.2.9人工接种及对样品的检测

3.2.10多重PCR方法与mini-VIDAS仪器法对比实验

4结果与分析

4.1 DNA模板的提取

4.2单重PCR特异性

4.3单重PCR灵敏度

4.4多重PCR特异性

4.5反应条件与反应体系的优化

4.6多重PCR的灵敏度

4.7人工接种及对样品的PCR检测

4.8多重PCR方法与mini-VIDAS仪器法对比实验

5结论与讨论

5.1结论

5.2讨论

附件1 冷却肉中沙门氏菌、大肠O157：H7和单增李斯特氏菌的多重PCR检测方法

参考文献

研究生期间发表的文章