巨噬细胞在CCl4诱导的小鼠肝纤维化恢复期中作用的研究

摘要

目的：研究巨噬细胞在CCl4诱导的小鼠肝纤维化恢复期的作用。
　　方法：健康雄性BALB/c小鼠（22.15±2.52）g，随机分为3组：对照组、模型组、实验组。模型组与实验组小鼠予以5％CCl4（0.6μL/g）行腹腔注射，2次/周；对照组腹腔注射橄榄油（0.6μL/g）2次/周，4周后所有小鼠停止注射。停止注射CCl4后模型组小鼠于尾静脉注射磷酸盐缓冲液（PBS）150μl2次/周,实验组小鼠于尾静脉注射氯磷酸二钠脂质体（CL）150μl2次/周，对照组不做处理，一周后处死所有小鼠，取部分肝左叶切成条状放入4%多聚甲醛固定，用于HE、天狼星红染色，免疫组化方法检测巨噬细胞（F4/80+）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、胶原蛋白-Ⅰ（Collagen-Ⅰ）、血小板源性生长因子（PDGFB）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、白介素-10（IL-10）的蛋白质水平，并采用IPP图像分析软件检测平均光密度值（OD），其余肝组织切成125mm3的小块-80℃冰箱保存待用。
　　结果：
　　1.肝纤维化模型建立:模型组小鼠肝组织中HE染色可见炎细胞浸润增多，汇管区结构紊乱；天狼星红染色显示纤维结缔组织增多。
　　2.巨噬细胞耗竭情况：应用巨噬细胞特异性抗体鼠抗F4/80进行肝组织免疫组化染色，明确巨噬细胞耗竭情况，其中棕黄色颗粒状物为阳性染色。正常对照组和注射PBS的模型组小鼠中均可见F4/80阳性表达的巨噬细胞，其光密度值（OD）分别为（0.326±0.026）、（0.331±0.015），而注射CL的实验组小鼠肝组织中只见少量F4/80阳性表达的巨噬细胞（OD为0.127±0.02）。与对照组和模型组相比，实验组中F4/80表达较低，差别均具有显著统计学意义；对照组与模型组之间无统计学差异。同时实验组中约有62%巨噬细胞被成功清除。
　　3.肝脏组织病理学观察。HE染色结果：对照组肝细胞形态正常，未见炎症及坏死区；模型组小鼠肝组织内可见少量坏死，主要位于中央静脉周围；而实验组小鼠肝组织损伤较模型组严重，中央静脉周围可见大量地图样坏死区，部分细胞核破碎。天狼猩红染色结果：对照组小鼠仅在汇管区和中央静脉壁可见少量胶原纤维；模型组可见环形分布的胶原沉积，主要位于小叶中央静脉、肝窦周围间隙。实验组中胶原纤维沉积明显增多，主要见于汇管区和中央静脉。
　　4.巨噬细胞耗竭对α-SMA、Collagen-I的影响：正常对照组小鼠肝组织中仅有少量α-SMA在血管壁平滑肌细胞表达，其OD值为（0.047±0.005）；模型组中α-SMA在汇管区及肝窦少量表达，其OD值为（0.064±0.005）；实验组在汇管区及肝窦大量表达，其OD值为（0.113±0.013）。与对照组相比，实验组α-SMA的表达较高，差别有统计学意义；与模型组比，实验组的表达稍高，差别同样有统计学意义；对照组与模型组间的表达无统计学差异。Collagen-I：对照组Collagen-I仅在汇管区和中央静脉壁少量表达，其OD为（0.085±0.013）；模型组在小叶中央静脉、肝窦周围间隙少量表达， OD值为（0.073±0.010）；实验组在肝窦间大量表达， OD值为为（0.198±0.029）。与对照组相比，实验组Collagen-I表达稍高，具有统计学意义;与模型组相比，实验组Collagen-I表达较高，有统计学差异；对照组与模型组间的表达无统计学差异。
　　5.巨噬细胞耗竭对炎症因子PDGFB、TNF-α、 IL-10蛋白表达水平的影响:PDGFB的表达主要位于阳性细胞的胞浆内，正常对照组小鼠仅在门静脉血管内呈轻微表达；模型组阳性表达主要见于肝窦旁及汇管区；实验组阳性表达增强，着色较深，主要分布于汇管区和窦周。免疫组化定量分析结果表明：实验组中 PDGFB的表达（0.133±0.006）高于模型组(0.110±0.003)和对照组（0.071±0.001），差别均有统计有意义；对照组和模型组之间亦有差异。TNF-α主要在阳性细胞的胞浆内表达，正常对照组在汇管区极少表达，模型组主要在汇管区、肝窦少量表达，实验组在汇管区、肝窦大量表达。免疫组化定量分析结果表明：实验组中TNF-α的表达（0.128±0.005）高于对照组（0.085±0.002）和模型组（0.106±0.005），差别均具有统计学意义。
　　正常对照组很少表达IL-10，模型组中IL-10主要分布在汇管区、肝窦、中央静脉周围，实验组中阳性细胞在中央静脉、汇管区少量表达。免疫组化定量分析结果表明：模型组 IL-10的表达明显高于正常组，差别有统计有意义；实验组表达量明显低于模型组，差别同样有统计有意义；而实验组的表达稍高于正常对照组，差别亦有统计学意义。
　　6.巨噬细胞耗竭对MMP-13蛋白表达水平的影响:MMP-13的表达主要位于阳性细胞的胞浆内，正常对照组极少表达。模型组中阳性染色多集中在纤维间隔、中央静脉周围、肝窦处的细胞胞浆。实验组主要在汇管区表达。免疫组化定量分析结果表明：模型组中MMP-13的表达（(0.154±0.016）高于正常组（0.089±0.003）和实验组（(0.108±0.003），差别均有统计有意义；实验组与对照组之间无差异。
　　结论：
　　1.在肝纤维化恢复阶段耗竭巨噬细胞，α-SMA表达上调，表明HSC活化增强，肝纤维化程度加重。
　　2.在肝纤维化恢复阶段耗竭巨噬细胞，促炎细胞因子TNF-α及促HSCs增值的PDGFB表达上调，抑炎因子IL-10表达下调。
　　3.在肝纤维化恢复阶段耗竭巨噬细胞，MMP-13表达减少，ECM降解受阻，肝纤维化恢复延缓。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验步骤

3 统计学处理

结果

2 巨噬细胞耗竭

附图

讨论

结论

参考文献

综述:巨噬细胞及其亚型在肝脏疾病中的研究进展

致谢

个人简历