巨噬细胞耗竭对CCL4诱导的小鼠急性肝损伤与慢性肝纤维化自然恢复的影响

摘要

目的：研究巨噬细胞耗竭对CCL4诱导的小鼠急性肝损伤与慢性肝纤维化自然恢复的影响
　　方法：
　　1.巨噬细胞耗竭对CCL4诱导的小鼠急性肝损伤的影响：15只雄性BALB/c小鼠（23.70±2.43）g,随机分为3组，即：对照组（ip Oil，n=5），未耗竭巨噬细胞的模型组(iv PBS,ip CCL4，n=5)，耗竭巨噬细胞的实验组(iv Clodronate-Liposomal，CL,ip CCL4，n=5)。我们的实验是基于Van Rooijen对氯膦酸二钠脂质体的报道,报道指出静脉内注射氯膦酸二钠脂质体可以选择性的清除体内巨噬细胞,巨噬细胞通过吞噬作用摄取脂质体,其膦脂酶破坏脂质体的膦脂双分子层,药物在细胞内释放从而诱导了巨噬细胞的凋亡。在实验第一天模型组小鼠于尾静脉注射PBS150μl,实验组小鼠于尾静脉注射CL150μL，对照组不做处理。尾静脉注射12h后进行CCL4或Oil的腹腔注射，模型组与实验组均腹腔注射5％CCL40.6μl/g，对照组腹腔注射橄榄油（Oil）0.6μl/g。24h后处死所有小鼠，分离血清-80℃保存以备检测丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate transaminase，AST）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）；取部分肝左叶切成条状放入4%多聚甲醛固定，用于HE染色和免疫组织化学巨噬细胞（F4/80+）的检测，并采用IPP图像分析软件检测累积光密度值（IOD）；其余肝组织切成125mm3的小块-80℃冰箱保存，用于RT-PCR检测一氧化氮合酶（iNos）、趋化因子16（CXCL16）的mRNA表达水平。
　　2.巨噬细胞耗竭对CCL4诱导的小鼠慢肝纤维化自然恢复的影响：9只雄性BALB/c小鼠（26.19±4.23）g,随机分为3组，即对照组（ip Oil，n=3），未耗竭巨噬细胞的模型组(iv PBS,ip CCL4，n=3)，耗竭巨噬细胞的实验组(iv CL,ip CCL4，n=3)。模型组与实验组小鼠均进行腹腔注射5%CCL40.6μl/g2次/周，对照组腹腔注射Oil0.6μl/g2次/周，4周后停止。停止注射CCL4后模型组小鼠于尾静脉注射PBS150μl2次/周,实验组小鼠于尾静脉注射CL150μl2次/周，对照组不做处理，一周后处死所有小鼠，分离血清-80℃保存以备检测ALT、AST、TBIL；同样取部分肝左叶切成条状放入4%多聚甲醛固定，用于HE染色和天狼猩红染色，并且用于免疫组织化学巨噬细胞（F4/80+）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、胶原蛋白-Ⅰ（collagen-Ⅰ）、转化生长因子（TGF-β1）的检测，并采用IPP图像分析软件检测IOD；其余肝组织切成125 mm3的小块-80℃冰箱保存，用于蛋白质免疫印记（Western blot）检测α-SMA、TGF-β1、CXCL16的蛋白表达水平。
　　结果：
　　1.巨噬细胞耗竭对CCL4诱导的小鼠急性肝损伤的影响：
　　通过免疫组织化学染色可见实验组约有80%的巨噬细胞被耗竭：应用F4/80标记肝脏组织中巨噬细胞，未耗竭巨噬细胞模型组于肝组织坏死区可见大量F4/80阳性表达的巨噬细胞，其累计光密度值（ IOD）为（21496.63±5907.46），耗竭巨噬细胞实验组肝组织中只可见极少量F4/80阳性表达的巨噬细胞，IOD为（4404.33±311.28），对照组可见中等量F4/80阳性巨噬细胞，IOD为（12491.26±3958.61）。模型组IOD明显高于实验组，差别具有显著统计学意义（P<0.01）。对照组IOD也高于实验组，差别具有统计学意义（P<0.01）。
　　HE染色组织学观察：模型组中肝脏中央静脉周围的肝细胞大量地图样坏死，实验组肝细胞坏死面积有所减少，对照组肝细胞形态正常，未见坏死区。
　　模型组血清ALT的水平（202.32±3.20）U/L,与对照组血清ALT水平（16.70±5.11）U/L相比明显升高，差别具有显著统计学意义（P<0.01）。模型组血清ALT水平与实验组血清ALT水平（200.60±6.34）U/L相比无明显统计学意义（P＞0.05）。模型组、实验组、对照组血清AST的水平分别为（292.90±8.64）U/L、（278.54±8.42）U/L、（64.64±30.18）U/L。与对照组血清AST水平相比模型组明显升高，差别具有显著统计学意义（P<0.01）。模型组血清AST水平与实验组相比有统计学意义（P<0.05）。模型组、实验组、对照组血清TBIL的水平分别为（19.49±1.16）μmol/L、（14.64±0.89）μmol/L、（6.68±0.17）μmol/L。模型组与对照组之间差异有明显统计学意义（P<0.01），实验组与模型组之间的差异也存在统计学意义（P<0.05）。
　　RT-PCR结果示：模型组中iNos的表达高于实验组，其差别具有统计学意义（P<0.05）。且模型组iNos的表达也高于对照组，差别具有显著统计学意义（P<0.01）。在模型组中CXCL16的表达高于对照组，其差别具有统计学意义（P<0.05）。并且模型组CXCL16的表达也高于实验组，差别具有统计学意义（P<0.05）。
　　2.巨噬细胞耗竭对CCL4诱导的慢肝纤维化自然恢复的影响：
　　通过免疫组织化学染色可见实验组约有62%的巨噬细胞被耗竭：应用F4/80标记肝脏组织中巨噬细胞，模型组和对照组都可见F4/80阳性表达的巨噬细胞，未耗竭巨噬细胞的模型组IOD为（45858.33±383.15），对照组IOD为（45209.00±7466.85），耗竭巨噬细胞的实验组肝组织中只可见极少量F4/80阳性表达的巨噬细胞，IOD为（17810.00±7663.55），模型组IOD明显高于实验组，差别具有显著统计学意义（P<0.01）。对照组IOD也明显大于实验组，差别具有显著的统计学意义（P<0.01）。
　　HE染色组织学观察：模型组及实验组中肝脏中央静脉周围可见大量肝细胞坏死区，对照组肝细胞形态正常，未见坏死区。
　　天狼猩红染色：模型组及实验组中均可见红色胶原沉积，模型组较少，对照组仅在汇管区可见少量阳性表达。
　　与对照组血清ALT水平（17.73±4.49）U/L相比模型组血清ALT的水平（13.97±6.34）U/L虽然稍低，但其差异无统计学意义。模型组血清ALT水平与实验组血清ALT水平（98.70±30.10）U/L相比有统计学意义（ P<0.05）。模型组、实验组、对照组血清AST的水平分别为（101.17±35.10）U/L、（202.20±35.60）U/L、（75.45±4.34）U/L。与对照组血清 AST水平相比模型组血清水平无明升高，差别无统计学意义。而模型组血清AST水平与实验组相比有统计学意义（P<0.05）。模型组、实验组、对照组血清TBIL的水平分别为（6.49±0.19）μmol/L、（8.73±1.71）μmol/L、（7.29±1.16）μmol/L。三组之间均无统计学意义。
　　模型组α-SMA IOD为（7850.83±1022.74），实验组大量表达α-SMA其IOD为（13815.0±3051.69），对照组IOD为（5756.67±1218.78）仅表达在血管平滑肌中，模型组与对照组无统计学意义。模型组与实验组差别存在统计学意义（ P<0.05），对照组与实验组差别存在统计学意义（P<0.05）。
　　模型组collagen-Ⅰ少量阳性表达，其IOD为（9517.67±2664.57），实验组IOD为（25747.00±7363.58），对照组极少量阳性表达 IOD为（11009.67±3272.93），对照组与实验组的差别有统计学意义（P<0.05）。模型组与实验组同样有统计学意义（P<0.05）。
　　模型组TGF-β1极少量阳性表达，其IOD为（9523.67±3266.61），实验组IOD为（20536.67±5196.5），对照组几乎呈阴性表达IOD为（8846.33±2677.30），实验组与对照组的差别有统计学意义（P<0.05）。模型组与实验组同样有统计学意义（P<0.05）。
　　结果：检测α-SMA在肝组织中的表达，模型组为（0.237±0.017），实验组为（0.490±0.016），对照组为（0.126±0.009），分析其结果可见模型组α-SMA表达量少于实验组，两组差别有统计学意义（P<0.05）。模型组表达量较对照组高，其差别存在统计学意义（P<0.05）。
　　检测TGF-β1在肝组织中的表达，模型组、实验组、对照组分别为（0.174±0.023）、（0.318±0.006）、（0.087±0.012），分析结果可见模型组表达量高于对照组，其差别存在统计学意义（P<0.05）。模型组TGF-β1表达量少于实验组，两组差别有统计学意义（P<0.05）。
　　检测CXCL16在肝组织中的表达，模型组为（0.236±0.044），实验组为（0.393±0.015），对照组为（0.117±0.013），分析其结果可见模型组CXCL16表达量少于实验组，两组差别有统计学意义（P<0.05）。模型组表达量较对照组高，其差别存在统计学意义（P<0.05）。
　　结论：
　　1.急性肝损伤期间耗竭巨噬细胞可改善肝功能，减少炎症因子的分泌，使肝损伤减轻，从而起到保护肝脏作用。
　　2.慢性肝纤维化自然恢复阶段耗竭巨噬细胞可加重肝功能损伤并增加炎症因子的分泌，阻碍细胞外基质消退，从而减缓了肝脏纤维化的恢复。

目录

封面

目录

中文摘要

英文摘要

英文缩写

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验步骤

3.0 统计学处理

结果

1 巨噬细胞耗竭情况

2 肝脏形态学表现

3 巨噬细胞耗竭对肝功能的影响

4 巨噬细胞耗竭对急性肝损时炎症因子iNos表达的影响

5 巨噬细胞耗竭对炎症因子CXCL16表达的影响

6 巨噬细胞耗竭对慢性肝纤维化恢复时炎症因子TGF-β1表达的影响

7 巨噬细胞耗竭对慢性肝纤维化恢复时HSCs活化即α-SMA表达的影响。

8 巨噬细胞耗竭对慢性肝纤维化恢复时collagen-Ⅰ表达的影响

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述: 巨噬细胞在肝纤维化中的作用

致谢

个人简历