大豆异黄酮转化菌株的分离、耐氧驯化及耐氧机制研究

摘要

大豆异黄酮(soy isoflavones)是大豆在其生长过程中形成的次级代谢产物，主要由黄豆苷原(daidzein)、染料木素(genistein)和黄豆黄素(glycitein)组成，具有抗氧化、抗癌、降低血脂、预防骨质疏松和改善妇女更年期综合症等多种生理功能。大豆异黄酮被人或其他动物摄入到体内后，会被胃肠道微生物菌群降解为各种不同代谢产物，其中黄豆苷原将被代谢二氢黄豆苷原（dihydrodaidzein，简称DHD）、雌马酚(equol)和去氧甲基安哥拉紫檀素(O-desmethylangolensin，简称O-Dma)等不同代谢产物。
　　 通过本研究从人粪样中分离出一株对黄豆苷原具有转化作用的革兰氏阴性严格厌氧细菌菌株AUH-Julong365。经BLAST比对，该菌株与缓慢爱格士菌属菌株Eggerthella lenta ATCC25559(AF292375)相似性最高，相似性为98.6％。通过与标准品对比高效液相保留时间、紫外吸收谱，结合质谱和核磁共振氢谱等分析结果，将菌株AUH-Julong365转化大豆异黄酮黄豆苷原后的产物鉴定为雌马酚。通过手性柱检测发现，该菌株转化底物黄豆苷原后生成的雌马酚为100％S-雌马酚。该菌株能够转化底物黄豆苷原的最大浓度为0.6 mmol/L。为提高菌株耐氧特性，本研究对严格厌氧细菌菌株AUH-Julong365进行了耐氧驯化，但最终并未得到能在有氧条件下生长且具有转化活性的耐氧突变株。
　　 细菌菌株Clostridium sp.AUH-JLC140是我们从公鸡新鲜粪样分离得到的革兰氏阳性严格厌氧梭菌属菌株，该菌株在厌氧条件下能将底物黄豆苷原高效转化为去氧甲基安哥拉紫檀素（O-Dma）。有关该菌株及其在合成O-Dma应用方面我们已于2011年11月申报国家发明专利，该专利于2012年10月被国家知识产权局授权(专利号:ZL201110367963.1)。为提高梭菌属菌株AUH-JLC140的耐氧能力，对该菌株进行了耐氧驯化，最终成功得到了一株能在有空气氧条件下生长且能将黄豆苷原转化为O-Dma的耐氧突变株，我们将该耐氧突变株命名为Aeroto-AUH-JLC140。
　　 耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140与出发菌株AUH-JLC140相比较在很多方面存在不同，包括细胞形态（中长杆变为小短杆黏联、菌体外壁新形成一层抗氧化“保护膜”结构）、生理生化特性（吲哚试验从阴性变为阳性;淀粉水解酶活性从阳性变为阴性;H2S反应从阴性变为阳性。当底物黄豆苷原浓度不超过0.6 mmol/L时，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140在有氧条件下对底物黄豆苷原的平均转化率为81.9％;向培养基中加入0.05％（m/v）L-半胱氨酸可将平均转化率由原来的81.9％提高至94.3％。耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140能耐受氧气的机制体包括:产H2S能力;形成抗氧化“保护膜”结构，菌体形态改变以及菌体生长速度变快等。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 大豆异黄酮的结构及其生理学功能

1．1．1 大豆异黄酮结构及种类

1．1．2 大豆异黄酮的理化性质

1．1．3 大豆异黄酮的生理功能

1．2 大豆异黄酮转化菌的研究现状

1．2．1 大豆异黄酮的吸收与代谢

1．2．2 大豆异黄酮转化菌株的分离筛选与鉴定

1．3 大豆异黄酮代谢产物的生物学活性

1．4 大豆异黄酮代谢产物的合成及存在问题

1．5 微生物的耐氧驯化

1．6 研究目的及意义

第二章 雌马酚产生茵的分离筛选与耐氧驯化

2．1 实验材料

2．1．1 菌株来源

2．1．2 培养基

2．1．3 药品与试剂

2．1．4 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 菌株分离

2．2．2 高效液相检测

2．2．3 菌种鉴定

2．2．4 转化所得产物的分离纯化与结构鉴定

2．2．5 黄豆苷原代谢产物的手征性测定

2．2．6 菌株对底物最大转化能力测定

2．2．7 大豆异黄酮转化菌株的耐氧驯化

2．3 结果与分析

2．3．1 黄豆苷原转化菌株的分离与鉴定

2．3．2 代谢产物的质谱(ESI-MS)和核磁共振氢谱(1H-NMR)

2．3．3 雌马酚的手征性测定

2．3．4 菌株AUH-Julong365对底物黄豆苷原最大转化能力测定

2．3．5 菌株AUH-Julong365的耐氧驯化

2．4 结论

第三章 O-Dma产生菌的耐氧驯化及生物学特性研究

3．1 实验材料

3．1．1 菌株来源

3．1．2 细菌生长及生理生化试验用培养基

3．1．3 药品与试剂

3．1．4 主要仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 耐氧驯化

3．2．2 耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140菌体形态观察

3．2．3 菌株生长特性

3．2．4 生理生化特性

3．2．5 驯化菌株Aeroto-AUH-JLC140基因组DNA提取

3．2．6 驯化菌株的16S rDNA序列分析

3．2．7 耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140的耐氧特性

3．3 结果与分析

3．3．1 耐氧驯化前后菌体形态比较

3．3．2 耐氧驯化前后菌体生长特性比较

3．3．3 耐氧驯化前后菌体生理生化特征比较

3．3．4 耐氧驯化前后菌株16S rDNA序列分析

3．3．5 耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140耐氧能力分析

3．4 结论

第四章 O-Dma产生菌耐氧突变株的有氧转化与调控研究

4．1 实验材料

4．1．1 药品与试剂

4．1．2 主要试验仪器与设备

4．2 实验方法

4．2．1 菌体转化效率计算方法

4．2．2 耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140有氧转化动态

4．2．3 耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140转化能力测定

4．2．4 刚果红染色

4．2．5 不同还原剂对耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140转化活性的影响

4．3 结果与分析

4．3．1 耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140对底物黄豆苷原的有氧转化

4．3．2 耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140对底物黄豆苷原的转化动态

4．3．3 耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140对底物黄豆苷原转化能力测定

4．3．4 耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140对底物黄豆苷原有氧转化调控

4．4 讨论

4．5 结论

第五章 O-Dma产生菌耐氧突变株的耐氧机制

5．1 实验材料

5．1．1 药品与试剂

5．1．2 主要仪器设备

5．2 实验方法

5．2．1 耐氧突变菌株Aeroto-AUH-JLC140主动驱氧策略

5．2．2 耐氧突变菌株Aeroto-AUH-JLC140主动防氧策略

5．2．3 耐氧突变菌株Aeroto-AUH-JLC140主动避氧策略

5．3 结果与分析

5．3．1 耐氧突变菌株Aeroto-AUH-JLC140主动驱氧机制

5．3．2 耐氧突变菌株Aeroto-AUH-JLC140主动防氧策略

5．3．3 耐氧突变菌株Aeroto-AUH-JLC140主动避氧策略

5．4 结论

创新点

结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢