原生质体融合提高大豆异黄酮还原菌株耐氧突变株的耐氧能力与有氧转化效率

摘要

迄今国内外报道的大豆异黄酮转化菌株均必须在严格厌氧条件下才能完成转化功能。为提高大豆异黄酮转化菌株的耐氧特性，本实验室经耐氧驯化，国内外首次将严格厌氧牛瘤胃细菌菌株Niu-O16驯化成为耐氧突变株Aeroto-Niu-O16，该耐氧突变株在有空气氧条件下既能生长又能将大豆异黄酮黄豆苷原(Daidzein)和染料木素(Genistein)分别还原为二氢黄豆苷原(Dihydrodaidzein，简称DHD)和二氢染料木素（Dihydrogenistein，简称DHG）。与野生菌株Niu-O16相比，耐氧突变株Aeroto-Niu-O16的耐氧能力明显提高，但耐氧突变株Aeroto-Niu-O16在有氧条件下的转化效率则显著低于野生菌株Niu-O16在厌氧条件下的转化效率。本研究将耐氧突变菌株Aeroto-Niu-O16与动物肠道优势需氧菌进行原生质体融合，以进一步提高耐氧突变株Aeroto-Niu-O16的耐氧能力与有氧转化效率。
　　 供试20株不同动物肠道优势需氧菌中，只有来自ICR小鼠肠道的M3、M4、M5和M6以及来自猪肠道的Z5对溶菌酶较为敏感。经进一步研究发现，5株溶菌酶敏感菌株中以来自ICR小鼠肠道的弗氏埃希氏菌株M6的原生质体制备率和再生率均最高。因此，以肠道优势需氧菌M6为试材，研究不同菌龄、酶浓度、酶解时间、渗透压稳定剂以及添加不同化学组分等对菌株M6原生质体制备与再生的影响，确定菌株M6原生质体制备与再生的最佳条件。将菌株M6的原生质体进行热灭活后，在PEG介导下与大豆异黄酮转化菌株耐氧突变株Aeroto-Niu-O16进行原生质体融合，筛选到一株能在有氧条件下生长并将大豆异黄酮黄豆苷原和染料木素分别高效还原为DHD和DHG的融合子，我们将该融合子命名为AUH-RHZ-1。
　　 融合子AUH-RHZ-1在淀粉水解酶活性及产氢性能上继承了灭活亲本菌株M6的特性，但在菌体形态、生理生化特征、16S rDNA序列、随机扩增多态性DNA(RAPD)及酯酶同工酶谱等许多方面则表现出与亲本菌株Aeroto-Niu-O16相同或相似特性。值得一提的是，亲本菌株Aeroto-Niu-O16在有空气氧条件下生长时会在其菌体外壁形成一层抗氧化“保护膜”结构，而融合子在相同条件下生长时在其外壁并未检测到类似的“保护膜”结构。此外，融合子AUH-RHZ-1对甲硝唑、阿奇霉素、庆大霉素等抗生素的耐受性明显高于双亲菌株。通过对比分析菌体生长过程中培养基氧化还原电位变化动态、接种量及培养基高度等对菌体生长的影响，发现融合子AUH-RHZ-1的耐氧能力明显高于亲本菌株Aeroto-Niu-O16;与亲本菌株Aeroto-Niu-O16相比，耐氧融合子AUH-RHZ-1在有氧条件下对不同浓度底物黄豆苷原转化效率明显高于亲本菌株Aeroto-Niu-O16，对不同浓度底物染料木素的转化效率也有不同程度提高。通过原生质体融合有效提高大豆异黄酮转化菌株耐氧突变株的耐氧能力与有氧转化效率为国内外首次报导。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 大豆异黄酮主要成分及其生理活性

1．1．1 大豆异黄酮的组成及结构

1．1．2 大豆异黄酮的生理活性

1．2 大豆异黄酮的代谢产物及其生理活性

1．2．1 大豆异黄酮代谢产物种类

1．2．2 大豆异黄酮代谢产物的生理活性

1．3 大豆异黄酮代谢产物的合成及存在问题

1．4 原生质体融合技术

1．5 研究意义和创新点

1．5．1 研究意义

1．5．2 创新点

第二章 动物肠道优势需氧菌的筛选及原生质体制备与再生

2．1 材料

2．1．1 实验菌株

2．1．2 试剂

2．1．3 主要实验仪器与设备

2．2 方法

2．2．1 肠道优势需氧菌对溶菌酶敏感性研究

2．2．2 ICR小鼠肠道优势需氧菌M6原生质体制备与再生

2．3 结果与分析

2．3．1 肠道优势需氧菌对溶菌酶敏感性研究

2．3．2 ICR小鼠肠道优势需氧菌M6原生质体制备与再生

2．4 讨论

2．5 结论

第三章 弗氏埃希氏菌株M6与耐氧突变菌株Aeroto-Niu-O16的原生质体融合研究

3．1 材料

3．1．1 融合用亲本菌株

3．1．2 试剂

3．1．3 主要实验仪器与设备

3．2 方法

3．2．1 耐氧突变株Aeroto-Niu-O16的原生质体制备与再生

3．2．2 单亲热灭活原生质体融合及融合子筛选

3．2．3 融合子AUH-RHZ-1的鉴定

3．3 结果与分析

3．3．1 耐氧突变株Aeroto-Niu-O16原生质体制备与再生

3．3．2 单亲热灭活原生质体融合及融合子筛选

3．3．3 融合子AUH-RHZ-1的鉴定

3．4 结论

第四章 融合子AUH-RHZ-1的耐氧能力与有氧转化效率

4．1 材料

4．1．1 试验菌株

4．1．2 试剂

4．1．3 主要仪器

4．2 方法

4．2．1 培养基氧化还原电位变化动态

4．2．2 接种量和培养基高度对融合子AUH-RHZ-1生长的影响

4．2．3 融合子AUH-RHZ-1对底物大豆异黄酮的最大转化能力测定

4．2．4 还原剂对融合子AUH-RHZ-1转化活性的影响

4．3 结果与分析

4．3．1 培养基氧化还原电位变化动态

4．3．2 接种量和培养基高度对融合子AUH-RHZ-1生长的影响

4．3．3 融合子AUH-RHZ-1对底物大豆异黄酮的最大转化能力测定

4．3．4 不同还原剂对融合子AUH-RHZ-1转化活性的影响

4．4 讨论

4．5 结论

结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢