虫草核苷类成分检测方法的建立与虫草多糖组成分析

摘要

虫草是一种重要的药用资源，但对生长环境要求苛刻，产量相对较低，因此价格昂贵。近年来，诸多学者尝试人工培植虫草或发酵虫草菌以获得相应的虫草产品来缓解虫草资源供不应求的局面。虫草及虫草产品种类繁多，故其质量的准确评价及有效成分的含量测定成为关键。本研究通过高效液相色谱、红外光谱等手段对虫草中核苷类及多糖成分进行分析，以期建立虫草有关成分的标准化检测方法;通过响应面法对虫草菌产多糖液体发酵培养基进行优化，以提高虫草多糖的产量。因此，本研究旨在对虫草资源的全面评价及进一步开发提供一定的理论依据。本文主要研究结果如下:
　　1、通过提取方法的比较和正交试验确定了虫草核苷类成分的最佳提取方法为超声提取法，最佳提取工艺为:以超纯水为提取溶剂，料液比为1∶50，常温超声提取30min。确定了虫草核苷类成分的检测方法，使用中科安泰C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，最佳色谱条件为:检测波长:260nm;流动相为A（甲醇）-B（水）二元梯度洗脱，洗脱程序为:0～10min，5％→10％A;10～20min，5％→20％A;20～35min，20％→10％A;35～40min，10％→5％A;流速:0.5mL/min;进样量:10μL;柱温:25℃;检测时间:40min;进样间隔:5min。经方法学验证，该方法线性关系良好、精密度高，适用性、重复性、加样回收率均符合2015版药典要求。
　　2、对虫草及发酵虫草菌粉中核苷类成分进行测定与比较，结果显示冬虫夏草虫体中所含的核苷类成分种类最多，但虫草素未检出;人工蛹虫草子实体中腺苷、尿苷、胸苷含量相对较高，虫草素含量高达3265.88μg/g;冬虫夏草菌CC-9发酵菌丝体中检出了5种核苷类成分，其中尿嘧啶和胸苷含量相对较高;冬虫夏草菌CC-10发酵菌丝体中虫草素未检出，但含有的核苷类成分种类较多且含量较高，检出肌苷含量为158.24μg/g，而在其他菌丝体中未检出;蛹虫草YC-1发酵菌丝体中虫草素含量为193.97μg/g，是本试验唯一检出虫草素的菌株，尿苷、鸟苷和腺苷含量均较高;蛹虫草YC-2发酵菌丝体中尿苷、鸟苷和腺苷含量最高，分别为4641.64μg/g、4214.05μg/g、2460.03μg/g，但虫草素未检出。
　　3、采用响应面法对冬虫夏草菌CC-10和蛹虫草菌YC-1产多糖液体发酵培养基进行优化，结果CC-10菌株最佳培养基配方为:葡萄糖9.32g/L、麦芽糖18.79g/L、蛋白胨6.14g/L、豆饼粉4g/L、MgSO40.5g/L、KH2PO41g/L、VB20.5mg/L，此时胞内多糖含量为4.16％，是优化前的2.06倍。YC-1菌株最佳培养基配方为:蔗糖20.75g/L、蛋白胨8.17g/L、酵母浸粉5g/L、KH2PO41g/L、MgSO41.20g/L、ZnSO40.5g/L、VB10.1g/L，多糖含量为6.77％，是优化前的2.34倍。
　　4、采用乙醇分级沉淀法对YC-1菌株和CC-10菌株的胞内及胞外多糖进行提取，进一步纯化后采用红外光谱法对各多糖组分进行扫描，结果显示10种组分均具有多糖特征吸收峰，其中YC-1菌株ESP1在819cm-1处和CC-10菌株ISP1在811cm-1处的吸收峰表征其含有甘露糖。CC-10菌株ISP2在835cm-1和889cm-1处的吸收峰表征其含有α和β糖苷键，ESP1在835cm-1处的吸收峰表征含有α-糖苷键。采用PMP柱前衍生高效液相色谱法对单糖组成进行分析，结果为YC-1菌株和CC-10菌株的胞内及胞外多糖主要含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸四种单糖，但每种多糖组分中单糖的种类和比例有所不同。

目录

声明

摘要

缩写词目录

第一章 前言

1．1 虫草概况

1．2 虫草主要活性物质及其药理作用简介

1．2．1 核苷类成分

1．2．2 虫草多糖

1．2．3 其他成分

1．3 虫草研究进展

1．3．1 虫草菌的分离与发酵

1．3．2 虫草核苷类成分分析研究进展

1．3．3 虫草多糖研究进展

1．4 本研究目的及意义

第二章 虫草核苷类成分检测方法的建立及含量测定

2．1 试验材料

2．1．1 试验样品

2．1．2 标准品及试剂

2．1．3 仪器与设备

2．2 试验方法

2．2．1 核苷类成分提取工艺确定

2．2．2 样品的制备

2．3 结果与分析

2．3．1 核苷类成分提取工艺确定

2．3．2 虫草核苷类检测方法的建立

2．3．3 方法学验证

2．3．4 虫草及虫草菌丝体中核苷类成分的检测结果

第三章 响应面法优化虫草菌产多糖液体发酵培养基

3．1 试验材料

3．1．1 菌株

3．1．2 培养基及试剂

3．1．3 仪器与设备

3．2 试验方法

3．2．1 培养方法

3．2．2 多糖含量测定

3．2．3 单因素试验

3．2．4 Plackett—Burman(PB)试验设计

3．2．5 最陡爬坡试验

3．3．2 单因素试验

3．3．3 PB试验筛选主效应因子

3．3．4 最陡爬坡试验

3．3．5 Box-Behnken中心组合试验结果与分析

3．4 讨论

第四章 虫草多糖的提取与初步结构分析

4．1 试验材料

4．1．1 试验样品

4．1．2 试验试剂

4．1．3 仪器与设备

4．2 试验方法

4．2．1 虫草多糖的提取分离

4．2．2 虫草多糖红外光谱分析

4．2．3 单糖组成分析

4．3 结果与分析

4．3．1 红外光谱分析

4．3．2 单糖组成分析

4．4 讨论

结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢