可视化环介导等温扩增技术检测食品中的驴源性成分

摘要

驴肉具有细嫩、美味、营养价值高等特点，是一种典型的高蛋白和低脂肪的肉制品。然而，驴肉资源相对比较缺乏，从而导致其价格不断攀升，促使一些不法分子使用廉价肉冒充驴肉，且该现象屡见不鲜，扰乱了市场诚信。传统检测方法费力耗时，无法实现快速检测。因此，开发一种简单、快速且灵敏的检测方法对于鉴别驴肉的真伪具有重要意义。
　　环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）在恒温条件下即可实现DNA扩增，但若精确判定结果通常需要繁琐的电泳。因此，本研究建立了一种新型的可视化LAMP检测方法，以省去繁琐的电泳操作步骤，减少耗时，为食品中驴源性成分快速、高灵敏的检测探索了新途径。
　　本研究分别利用苯酚-氯仿抽提法、KI法、氯仿-醋酸钠法和试剂盒法对DNA的提取效果进行了比较，结果表明4种方法的提取效果无明显差别。由于试剂盒法具有速度快、简捷、不需要使用有毒的苯酚等试剂、也不需要乙醇沉淀等步骤的特点，所以综合考虑选择试剂盒法提取DNA。
　　本研究根据驴的线粒体ATPase6基因设计引物，对LAMP反应体系和反应条件进行优化，确定了最优的反应体系和反应条件:DNA模板1.0μL，内引物FIP/BIP各1.6μL，外引物F3/B3各0.2μL，dNTPs2.5μL，Mg2+4μL，Bst DNA聚合酶缓冲液2.0μL，8UBst DNA聚合酶2.0μL，无菌的去离子水补足体系至25μL。首先在62℃水浴锅中反应60min，然后80℃水浴5min终止反应。
　　本研究为验证引物的特异性，选取了18种肉样进行检测。结果显示，只有含驴源性成分的肉样呈现阳性结果，其它不含驴源性成分的肉样呈现阴性结果，表明该引物特异性良好。
　　本研究结果表明，LAMP方法检测食品中驴源性成分的凝胶电泳法和沉淀可视化法灵敏度为0.001ng/μL，荧光可视化法灵敏度为0.0001ng/μL，实时荧光PCR方法灵敏度为0.01ng/μL。可见，LAMP凝胶电泳法和沉淀可视化法的灵敏度是实时荧光PCR方法的10倍，LAMP荧光可视化法灵敏度是实时荧光PCR方法的100倍。因此，可视化LAMP是更为灵敏的检测方法。
　　本研究分别采用实时荧光PCR和可视化LAMP方法对85份实际样品进行检测，并对可视化LAMP方法的敏感性、特异性及符合率进行评价。实时荧光PCR法检出的伪驴肉样品数为4个，可视化LAMP方法检出的伪驴肉样品数为5个。结果表明可视化LAMP方法的敏感性为100％，特异性为98.77％，符合率为98.82％。
　　综上所述，利用可视化LAMP方法检测食品中的驴源性成分切实可行。与LAMP凝胶电泳法和实时荧光PCR方法相比，该方法不需要使用昂贵的仪器、省去了繁琐的电泳过程、操作快速简便、成本低、耗时短、特异性和灵敏度较高，且结果判断直观，特别适合在基层检测机构推广应用。

目录

声明

摘要

1．1研究目的及意义

1．2国内外研究进展

1．2．1驴肉的营养价值与研究现状

1．2．2驴的特异性基因

1．2．3驴肉及其制品检测方法的研究进展

1．3存在的主要问题

1．4本研究的主要内容

1．4．1环介导等温扩增(Loop-medimed Isothermal Amplification，LAMP)技术

1．4．2研究内容

2．1．1试验材料

2．1．2仪器与设备

2．1．3主要试剂

2．2试验方法

2．2．1动物基因组DNA的提取

2．2．2模板DNA的纯度及浓度检测

2．2．3 LAMP的引物设计

2．2．4引物的稀释及保存

2．2．5 LAMP的预反应体系及反应程序

2．2．6实时荧光PCR反应中引物和探针的设计

2．2．7实时荧光PCR扩增的反应体系、反应程序及结果的判定

2．3 LAMP反应条件的优化

2．3．1引物缺省试验

2．3．2反应温度对LAMP反应扩增效率的影响

2．3．3不同反应时间对LAMP反应扩增效率的影响

2．3．4 Mg2+添加量的优化

2．3．5 dNTPs浓度的优化

2．3．6 Bst DNA聚合酶缓冲液添加量的优化

2．3．7甜菜碱对LAMP反应的影响

2．3．8内外引物比的优化

2．3．9 Bst DNA聚合酶大片段添加量的优化

2．4．0模板添加量的优化

2．4 LAMP引物特异性分析

2．4．1凝胶电泳法特异性分析

2．4．2沉淀可视化法特异性分析

2．6．1 LAMP反应的凝胶电泳法灵敏度

2．6．2实时荧光PCR扩增反应的灵敏度

2．6．3 LAMP反应的沉淀可视化法灵敏度

2．6．4 LAMP反应的荧光可视化法灵敏度

2．7可视化LAMP方法的实际应用

3结果与分析

3．1模板DNA提取方法的比较

3．2模板DNA的纯度及浓度检测结果

3．3 LAMP反应条件的优化

3．3．1引物缺省试验

3．3．2反应温度对LAMP反应扩增效率的影响

3．3．3反应时间对LAMP反应扩增效率的影响

3．3．4 Mg2+添加量的优化

3．3．5 dNTPs添加量的优化

3．3．6 Bst DNA聚合酶缓冲液添加量的优化

3．3．7甜菜碱对LAMP扩增效率的影响

3．3．8内外引物浓度比的优化

3．3．9 Bst DNA聚合酶大片段添加量的优化

3．4．0模板添加量的优化

3．4优化后的LAMP反应体系

3．5 LAMP引物特异性验证

3．5．1凝胶电泳法特异性判定

3．5．2沉淀可视化法特异性判定

3．5．3荧光可视化法特异性判定

3．6 LAMP扩增产物的酶切结果

3．7 LAMP反应的灵敏度分析

3．7．1 LAMP反应的凝胶电泳法灵敏度

3．7．2实时荧光PCR扩增反应的灵敏度

3．7．3 LAMP反应的沉淀可视化法灵敏度

3．7．4 LAMP反应的荧光可视化法灵敏度

3．8可视化LAMP方法的实际应用与评价

4讨论

4．3 LAMP反应中有关引物的设计

4．4影响LAMP反应的主要因素

4．5 LAMP反应体系的特异性

4．6 LAMP反应的污染因素及防治措施

5结论

参考文献

作者简历

致谢