基于环介导等温扩增转基因成分可视化检测技术研究

摘要

环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一种快速、灵敏度高、特异性强的等温核酸扩增技术，已被广泛用于各领域。同时，LAMP的高灵敏度也使扩增产物开盖检测极易出现污染，而利用闭管检测技术能有效降低污染机率。目前， LAMP结果检测方法主要有电泳、浊度分析、荧光染料、LFD、微流控等，其中应用较多的是电泳、浊度分析、HNB以及SYBR Green I指示剂。现有方法存在需开盖、材料昂贵、颜色变化均属同一色系等不足，为此本实验进行了三项独立的研究，主要研究成果如下：
　　(1) LAMP-ACBK检测系统：本实验引入一种新型的金属指示剂-酸性络蓝 K（Acid Chrome Blue K，ACBK）建立了闭管LAMP结果可视化检测技术。首先，我们在LAMP扩增的起始体系中，分别测试了ACBK与缓冲液、dNTPs、引物、Mg2+等组分的反应，确定了含ACBK的LAMP体系其颜色变化由Mg2+决定，化学方法也进一步验证了这一结论。随后以花椰菜花叶病毒35S启动子（CAMV35S，35S）为靶基因，建立了35S LAMP-ACBK检测体系。该体系的检测灵敏度针对转基因水稻的检测限为100拷贝，在分别含有50 ng的水稻、大豆、油菜和玉米基因组中能检测出0.1％的转基因含量。同时，利用不同转化事件及不同转基因作物为材料验证了其检测特异性，结果表明构建的35S LAMP-ACBK检测系统具有很强的检测特异性。最终，将该检测体系成功用于对实际玉米样品转基因成分的检测，检测结果既可以裸眼直接判断也可以借助紫外可见光谱分析。
　　(2) LAMP-G-四联体过氧化物酶检测系统：以G-四联体过氧化物酶实验所产生的绿色为基础建立了 LAMP扩增和结果可视化检测技术。首先，在 LAMP扩增体系中分别加入（FIP/BIP，FLP/BLP），（FIP/BIP-G4，FLP/BLP），（FIP/BIP，FLP/BLP-G4），（FIP/BIP-G4， FLP/BLP-G4）四组引物组合，在63°C（12，24，36，48，60）min，85°C2 min扩增条件下扩增，确定了（FIP/BIP，FLP/BLP-G4）为LAMP扩增引物。随后以含35S的转基因材料模板，建立了35S LAMP-G-四联体过氧化物酶检测系统，且该系统针对转基因水稻的检测限为32 ng/μL。同时，利用不同转化事件及不同作物的转基因材料验证了其检测特异性，结果表明构建的35S LAMP-G-四联体过氧化物酶检测系统具有很强的检测特异性。
　　(3) LAMP-试纸条检测系统：本研究旨在建立一种基于试纸条的35S或TNOS的LAMP扩增结果检测方法，该方法在LAMP扩增结束后2-3 min内即可用肉眼判读结果。首先对修饰后的LAMP引物做了可用性检测，随后，对试纸条的特异性及灵敏度进行了评价。结果显示，评价所用的5种阳性样品均出现质控线与检测线，电泳呈特异的梯状条带，与普通PCR结果一致。表明该试纸条可用于35S及TNOS LAMP扩增结果的检测，且有较高的特异性，两种试纸条的灵敏度分别为5.4 ng/μL、27.2 ng/μL。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

主要符号表

第一章 引言

1.1 国内外研究概况

1.1.1 电泳

1.1.2 荧光染料法

1.1.3 基于镁离子、焦磷酸根的检测技术

1.1.4 与其他技术结合的检测技术

1.2 本论文研究目的、意义与主要研究内容

1.2.1 研究目的和意义

1.2.2 主要研究内容

1.3 实验原理

1.3.1 LAMP-ACBK检测系统

1.3.2 LAMP-G-四联体过氧化物酶检测系统

1.3.3 LAMP-试纸条检测系统

第二章 ACBK可视化检测LAMP扩增结果

2.1 材料和方法

2.1.1 材料

2.1.2 方法

2.2 结果与分析

2.2.1 ACBK指示剂在LAMP体系中的可行性分析

2.2.2 LAMP扩增体系确定

2.2.3 特异性

2.2.4 灵敏度

2.2.5 对实际样品的检测

2.3 讨论

第三章 G四联体可视化检测LAMP扩增结果

3.1 材料

3.1.1 实验材料

3.1.2 试剂

3.1.3 主要仪器设备

3.1.4 引物

3.2 方法

3.2.1 DNA提取

3.2.2 DNA扩增

3.2.3 G-四联体过氧化物酶实验

3.2.4 hemin指示浓度及检测液加样量筛选

3.2.5 特异性与灵敏度实验

3.3 结果与分析

3.3.1 引物G4序列对LAMP扩增影响

3.3.2 hemin指示浓度及检测液加样量筛选

3.3.3 特异性

3.3.4 灵敏度

3.4 讨论

第四章 试纸条可视化检测LAMP扩增结果

4.1 材料和方法

4.1.1 材料

4.1.2 实验方法

4.2 结果与分析

4.2.1 特异性

4.2.2 灵敏度

4.3 讨论

结论

参考文献

个人简历

致谢