跨越式滚环等温扩增技术检测婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌的研究

摘要

克罗诺杆菌（Cronobacter spp.）是一种新型的食源性条件致病菌，主要通过婴幼儿配方奶粉感染新生儿和婴儿，并引起诸多疾病且具有很高的致死率。目前，国内外关于克罗诺杆菌的检测主要是传统检测方法，该方法灵敏度低，耗时长，不能达到快速检测的要求。因此，开发一种快速、灵敏的方法检测婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌是至关重要的。
　　本研究建立了一种新型的跨越式滚环等温扩增(Saltatory rolling circle amplification，SRCA)方法检测婴幼儿配方奶粉中的克罗诺杆菌。该方法只需要一对引物即可完成扩增，可通过肉眼直接观察沉淀和荧光，实现了结果判定的可视化。
　　本研究利用克罗诺杆菌rpoB基因进行特异性引物设计。通过优化，建立了SRCA的最优反应体系:正反向引物各0.5μM，模板1μL，dNTPs2mM，Mg2+2.5mM，10×ThermoPol Buffer2μL，8UBst DNA聚合酶，添加去离子水至20μL。最优的反应条件为:首先94℃预变性3min，然后冰浴2min。62℃下反应60min，最终80℃5min终止反应。
　　本研究选取48株菌，包括16株克罗诺杆菌和32株非克罗诺杆菌对SRCA引物的特异性进行验证。结果表明所有的克罗诺杆菌菌株呈阳性结果，非克罗诺杆菌均呈阴性结果。因此，SRCA引物具有良好的特异性。
　　本研究分别通过试剂盒法对克罗诺杆菌的纯培养物和人工污染样品提取模板DNA来进行SRCA反应，并与PCR方法比较。结果表明，通过凝胶电泳法及沉淀可视法检测纯菌的灵敏度为3.4×102CFU/mL，荧光可视法灵敏度为3.4×101CFU/mL，PCR方法灵敏度为3.4×104CFU/mL;SRCA方法检测人工污染婴幼儿配方奶粉中的克罗诺杆菌，凝胶电泳法及沉淀可视法检出限为3.4×102CFU/g，荧光可视法检出限为3.4×101CFU/g，PCR方法检出限为3.4×104CFU/g;建立的SRCA方法对富集12小时后的人工污染婴幼儿配方奶粉中的克罗诺杆菌进行检测，其凝胶电泳法及及沉淀可视法检出限为8.7×100CFU/g，荧光可视法检出限为8.7×10-1CFU/g，PCR方法的检出限为8.7×102CFU/g。因此，SRCA沉淀可视法及凝胶电泳法的灵敏度和检出限是PCR方法的102倍;荧光可视法灵敏度和检出限是PCR方法的103倍;SRCA荧光可视法的灵敏度及检出限是沉淀可视法和凝胶电泳法的10倍。
　　本研究采用国标方法(GB4789.40-2016)和SRCA方法对85份婴幼儿配方奶粉样品进行检测，并对SRCA方法的敏感性、特异性及符合率进行评价。结果显示国标方法检出阳性样品数为1个，SRCA方法检出阳性样品数为3个。计算得出SRCA方法的敏感性为100％，特异性为97.62％，符合率为97.65％。
　　本研究成功建立了SRCA检测婴幼儿配方奶粉中的克罗诺杆菌的方法。该方法具有快速、操作便捷、成本低、对实验设备要求低等优点，为克罗诺杆菌的快速检测开辟了新的途径，尤其在基层检验检疫机构具有很好的应用前景。

目录

声明

摘要

1．1 研究目的及意义

1．2 克罗诺杆菌国内外研究进展

1．2．1 克罗诺杆菌的分类

1．2．2 克罗诺杆菌的基本特征

1．2．3 克罗诺杆菌致病机制

1．2．4 克罗诺杆菌的特异性基因

1．3 克罗诺杆菌检测方法研究进展

1．3．1 传统的检测方法

1．3．2 免疫学方法

1．3．3 分子生物学方法

1．3．4 其他克罗诺杆菌检测方法

1．4 存在的主要问题

1．5 研究的主要内容

1．5．1 SRCA反应的原理

1．5．2 SRCA产物的检测方法

1．5．3 研究内容概要

2．1 试验菌株

2．2 主要培养基

2．3 试剂与试剂盒

2．4 仪器与设备

2．5 研究方法

2．5．1 菌株的培养

2．5．2 细菌基因组DNA的提取

2．5．3 SRCA引物设计

2．5．4 SRCA预反应体系

2．5．5 传统PCR反应体系及反应程序

2．6 SRCA反应条件和体系优化

2．6．1 引物缺省研究

2．6．2 反应温度优化

2．6．3 反应时间优化

2．6．6 Bst DNA聚合酶缓冲液添加量优化

2．6．7 引物添加量优化

2．6．8 模板添加量优化

2．6．9 Bst DNA聚合酶大片段添加量优化

2．7 引物特异性分析

2．8 SRCA扩增产物的结果分析

2．8．1 SRCA扩增产物测序分析

2．8．2 SRCA扩增产物酶切验证

2．9 灵敏度分析

2．9．1 SRCA反应的灵敏度

2．9．2 SRCA凝胶电泳法进行灵敏度测定

2．9．3 SRCA反应沉淀可视法进行灵敏度分析

2．9．4 SRCA反应荧光可视法进行灵敏度分析

2．10．2 SRCA凝胶电泳检出限测定

2．10．3 SRCA反应沉淀可视法检出限

2．10．4 SRCA反应荧光可视法检出限

2．10．5 传统PCR反应的检出限

2．11．3 SRCA反应沉淀可视法检出限

2．11．4 SRCA反应荧光可视法检出限

2．11．5 传统PCR检出限测定

2．12 SRCA方法的实际应用

3．1．1 引物缺省试验

3．1．2 反应温度优化

3．1．3 反应时间优化

3．1．4 Mg2+添加量优化

3．1．5 dNTPs添加量优化

3．1．6 Bst DNA聚合酶缓冲液添加量优化

3．1．7 引物添加量优化

3．1．8 模板添加量优化

3．1．9 Bst DNA聚合酶大片段添加量优化

3．2 优化后的SRCA反应体系

3．3 引物特异性验证

3．3．1 SRCA凝胶电泳法特异性

3．3．2 SRCA沉淀可视法特异性

3．3．3 SRCA荧光可视法特异性

3．4 SRCA扩增产物分析

3．4．1 SRCA扩增阪崎克罗诺杆菌产物的测序分析

3．4．2 SRCA扩增阪崎克罗诺杆菌产物的酶切分析

3．5 SRCA的灵敏度分析

3．5．1 SRCA凝胶电泳法灵敏度

3．5．2 SRCA沉淀可视法灵敏度

3．5．3 SRCA荧光可视法灵敏度

3．5．4 传统PCR凝胶电泳法灵敏度

3．6 检出限分析

3．6．1 SRCA凝胶电泳法检出限

3．6．2 SRCA沉淀可视法检出限

3．6．3 SRCA荧光可视法检出限

3．6．4 传统PCR反应的检出限

3．7 经过富集后的检出限

3．7．1 SRCA凝胶电泳检出限

3．7．2 SRCA沉淀可视法检出限

3．7．3 SRCA荧光可视法检出限

3．7．4 传统PCR凝胶电泳法检出限

3．8 SRCA方法的实际应用与评价

4．1 对SRCA方法的评价

4．2 SRCA的主要影响因素

4．3 特异性基因的选择及引物设计

4．4 富集的目的

4．5 SRCA反应产物分析

4．6 展望

5 结论

参考文献

作者简历

硕士期间发表学术论文

致谢