蓝莓花青素提取、纯化、成分鉴定及抗氧化活性的研究

摘要

蓝莓，又称越橘、蓝浆果，基本营养成分为果糖、蛋白质、脂肪、氨基酸、紫檀芪、超氧化物歧化酶等，富含花青素，在小肠中的吸收率高，具有降血糖、抗炎、抗肿瘤和增殖作用。贵州省麻江县从2000年春开始引种蓝莓，到2008年止，共引入蓝莓4大类30个品种，其中，兔眼蓝莓12个，北高丛蓝莓10个，半高丛蓝莓4个，南方高丛蓝莓4个，并筛选出适宜的品种10个。但目前对贵州境内的蓝莓研究报道较少，本文以麻江产兔眼蓝莓（品种：园蓝）为研究对象，对其进行花青素的提取、纯化工艺的研究，同时对所含花青素种类进行鉴定，并对其体外抗氧化活性进行测定。本文成果主要体现在：
　　1.采用超声辅助溶剂提取工艺，设计单因素试验考察不同酸化剂类型、酸化剂用量、超声温度、超声时间、乙醇体积分数、料液比、提取次数，根据单因素试验结果选取乙醇体积分数、盐酸用量及超声温度这三个因素设计响应面Box-Behnken试验，优化超声提取蓝莓花青素的提取工艺参数；后续纯化考查了乙酸乙酯萃取、大孔树脂吸附法纯化蓝莓花青素提取物的效果。最终优化后的提取条件为：超声温度40℃，盐酸用量为0.3％（V/V），乙醇体积分数为95%，超声时间20 min，1：6料液比提取3次，得提取物花青素187.92mg/100 g蓝莓。纯化条件：15 mL蓝莓粗提浓缩液，加入30 mL去离子水混合后，加入30 mL乙酸乙酯，萃取4次，花青素质量从粗提液187.92 mg/100 g减少至135.32 mg/100 g。树脂纯化实验表明：AB-8树脂吸附率、解吸率更高，当吸附时间大于1.5 h后，花青素吸附已达到平衡；0.3%（V/V）盐酸酸化95%乙醇洗脱剂效果最好，最终70 mL洗脱剂就能将花青素洗脱完全，得到经AB-8大孔树脂纯化后花青素含量为95.83 mg/100 g。
　　2.采用高效液相-质谱（HPLC-ESI-MS/MS）联用液相色谱（HPLC-PDA）鉴定并确认了贵州省麻江县种植的兔眼蓝莓（品种：园蓝）18个单体花青素，分别是：飞燕-3-半乳糖苷、飞燕-3-葡萄糖苷、矢车菊-3-半乳糖苷、飞燕-3-阿拉伯糖苷、矢车菊-3-葡萄糖苷、矢车菊-3-阿拉伯糖苷、矮牵牛-3-葡萄糖苷、芍药-3-半乳糖苷、矮牵牛-3-阿拉伯糖苷、芍药-3-葡萄糖苷、锦葵-3-半乳糖苷、芍药-3-阿拉伯糖苷、锦葵-3-葡萄糖苷、矢车菊素、锦葵-3-阿拉伯糖苷、矮牵牛素、芍药素、锦葵素。兔眼蓝莓中锦葵类占花青素总量36.93%，其次是矢车菊类占总量26.76%、飞燕类占总量16.69%，其中单体花青素含量最高为锦葵-3-葡萄糖苷15.86%。而市售蓝莓提取物（由上海惠城生物科技有限公司提供）花青素种类仅为四种，分别是：矢车菊-3-葡萄糖苷、芍药-3-葡萄糖苷、矢车菊素、芍药素。
　　3.2,2-联苯基-1-苦基肼基，即DPPH?(λmax=515 nm)分光光度比色法测花青素(λmax=520 nm)抗氧活性时，反应剩余色素干扰明显，导致DPPH?的微弱的吸光度值变化难以读出。引进液相色谱法，根据花青素与DPPH·不同的保留时间，将其区别，避免了反应剩余花青素的干扰，利用DPPH·反应前后的峰面积差即可算出DPPH?自由基清除率，提高了数据的精准性。最终，单体花青素抗氧化实验中，自制蓝莓花青素中矢车菊素、矮牵牛素、芍药素、锦葵素完全反应，飞燕-3-半乳糖苷、飞燕-3-葡萄糖苷、飞燕-3-阿拉伯糖苷，减少率分别为21.62、22.24、22.38%，其中矢车菊-3-葡萄糖苷面积减少率为4.04%。抗氧化活性最强的花青素单体分别为：矢车菊素、矮牵牛素、芍药素、锦葵素、飞燕-3-半乳糖苷、飞燕-3-葡萄糖苷、飞燕-3-阿拉伯糖苷。实验室制备经乙酸乙酯萃取除杂后后的蓝莓提取物质量浓度为1 mg/mL时，清除率达到最高，为85.74%，而市售蓝莓提取物（由上海惠城生物科技有限公司提供）浓度为1.5 mg/mL时最高，清除率为80.64%。蓝莓粗提液的DPPH·自由基清除率为75.27%，经乙酸乙酯萃取除杂后4次后的蓝莓提取物DPPH·自由基清除率达到84.93%，经AB-8大孔树脂纯化后的蓝莓提取物DPPH·自由基清除率仅为74.16%。

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第一章 绪论

引言

1 花青素提取纯化方法

2 蓝莓花青素生物活性

3 蓝莓中花青素成分研究

4 抗氧化活性测定新方法

5 多酚类天然产物在卷烟中的应用

6. 论文选题的背景、意义和研究内容

第二章 蓝莓花青素提取、纯化工艺优化

引言

2.1 实验部分

2.2 结果与讨论

2.3 本章小结

第三章 蓝莓花青素的结构鉴定及定量分析方法比较

引言

3.1 实验部分

3.2 结果与讨论

3.3 本章小结

第四章 蓝莓花青素抗氧化活性的测定

引言

4.1 实验部分

4.2 结果与讨论

4.3 本章小结

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 创新点

5.3 展望

致谢

参考文献

八 附录

九 图版