卷柏提取物降脂保肝作用及对HUVEC细胞VEGF蛋白表达影响的实验研究

摘要

卷柏为蕨类卷柏科(Selaginellaceae)卷柏属(Selaginella)植物卷柏(Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring)的全草。为了解卷柏物质基础,本实验室前期,对卷柏化学成分进行了全面系统的研究,从中分离得到大量的黄酮类、木脂素类、核苷类和其他多酚类化合物成分；活性研究采用去卵巢大鼠模型研究卷柏雌激素作用时发现卷柏提取物具有降脂活性,且正丁醇部位降脂活性最佳。考虑工艺要适合工业化大生产,采用新的卷柏提取方法为：卷柏70%乙醇回流提取得到总部位,将总部位上聚酰胺柱,依次以水、50%乙醇、80%乙醇梯度洗脱,洗脱液减压浓缩、干燥得各洗脱部位,并通过糖尿病大鼠模型和高脂血症大鼠模型研究发现卷柏降脂降糖活性主要集中于卷柏 80%乙醇部位(即黄酮类化合物),该部位具有抗氧化和清除自由基,降胆固醇、降血脂、降糖、改善胰岛素抵抗等多种功效。
　　工艺通过中试验证发现其成本较高,因此在前期实验的基础上对卷柏的提取方法改为：95%乙醇回流药渣水提法,卷柏全草 95%乙醇回流提取,提取物减压浓缩干燥得到 95%乙醇部位。95%乙醇提取后的药渣用水煎煮,水煎液减压浓缩干燥得到药渣水提物。
　　本课题在前期研究的基础上,以卷柏80%乙醇部位为对照,并采用新的提取方法对卷柏提取物干预和治疗非酒精性肝损伤进行研究,以期筛选出卷柏黄酮降脂保肝作用的最优剂量及卷柏黄酮富集的最佳提取方法,同时为明确卷柏黄酮在预防和治疗非酒精性肝损伤和动脉粥样硬化的作用机理奠定基础。
　　第一部分 卷柏提取物对饮食诱导肝损伤大鼠预防和治疗作用的实验研究
　　目的：建立 Wistar大鼠饮食诱导肝脏脂肪变性模型,初探卷柏提取物降脂保肝作用机制。
　　方法：成年Wistar大鼠70只,雌雄各半,体重为(200±20) g,适应性喂养一周,随机分出10只为正常对照组；其余动物腹腔注射60万单位维生素D3的同时给予高脂饲料,实验动物自由饮水、进食。造模开始后干预组在造模的同时给药,治疗组造模成功后给药。
　　给药12周后处死老鼠,测定体重、肝重,计算肝指数；取血清测定生化、肝功、血流变、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)指标；酶联免疫吸附法(ELISA)测定脂肪酸β氧化相关蛋白—肉毒碱棕榈酰转移酶Ⅰ(CTP-Ⅰ)和脂酰辅酶A合成酶(ACS)的活性；光镜和电镜下观察肝脏组织结构变化。
　　结果：给药12周后,干预实验中模型组大鼠血清生化指标及肝功指标等显著升高,血清MDA含量增加,SOD含量降低(与正常组比P﹤0.01),全血粘度、血浆粘度、红细胞刚性指数显著升高,红细胞变形指数显著减低,但红细胞压积没有变化；肝脏CTP-1和ACS水平显著减低(与正常组比P﹤0.01),给药组各项指标明显改善,其中以卷柏95%部位和卷柏80%Ⅱ部位作用最好。病理切片HE染色光镜照片发现,正常组肝组织切片肝组织功能基本正常；模型组肝细胞形成了以大泡性为主的肝细胞脂肪变,给药后各组肝脏病理改变一定的改善作用。
　　治疗组造模一月后模型组大鼠出现了广泛的细胞内小泡性脂肪变性,说明造模成功。给药12周后,治疗实验中模型组大鼠血清生化指标及肝功指标等显著升高,血清MDA含量增加,SOD含量降低(与正常组比P﹤0.01),全血粘度、血浆粘度、红细胞刚性指数显著升高,红细胞变形指数显著减低,但红细胞压积没有变化；肝脏CTP-1和ACS水平显著减低(与正常组比P﹤0.01),给药组各项指标明显改善,其中以卷柏95%部位和卷柏80%Ⅱ部位作用最好。病理切片HE染色光镜照片发现,正常组肝组织切片肝组织功能基本正常；模型组肝细胞形成了以大泡性为主的肝细胞脂肪变,卷柏提取物对各组大鼠肝脏病理改变有明显的改善作用。观察电镜表现的严重程度和病理一致,即随着肝组织病理变化的加重电镜下的改变也呈加重趋势。
　　结论：卷柏黄酮对高脂饲料引起的脂代谢紊乱及肝细胞脂肪变性具有较好的干预和治疗作用,且具较好的量效关系。
　　第二部分 卷柏提取物及穗花杉双黄酮对 HUVEC细胞增殖的影响
　　目的：观察卷柏总黄酮、穗花杉双黄酮对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖及血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响,为动脉粥样硬化引起的心肌和肢体缺血的促血管新生治疗提供理论依据。
　　方法：采用MTT法检测不同浓度卷柏总黄酮及穗花杉双黄酮对 HUVEC细胞增殖的影响；流式细胞仪检测细胞周期；Western blot检测VEGF蛋白的表达。
　　结果：不同浓度的卷柏总黄酮(1、5、10、15、20μg·mL-1)和穗花杉双黄酮(0.3、1、2、4、5μg·mL-1)可以剂量依赖地促进 HUVEC细胞增殖,其中卷柏总黄酮10μg·mL-1、穗花杉双黄酮1μg·mL-1在36h时显著促进细胞增殖,提高S期细胞比例,VEGF蛋白表达明显升高。
　　结论：细胞实验结果提示卷柏中黄酮类物质可能具有促血管新生的作用。

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前言

第一部分 卷柏提取物对饮食诱导大鼠肝脏脂肪变性干预和治疗作用的实验研究

实验 1 卷柏提取物对饮食诱导大鼠肝脏脂肪变性干预作用的实验研究

材料与方法

结果

实验 2 卷柏提取物对饮食诱导大鼠肝脏脂肪变性治疗作用的实验研究

材料与方法

结果

讨论

第二部分 卷柏提取物及穗花杉双黄酮对HUVEC细胞增殖的影响

材料和方法

结果

讨论

结论

致谢

参考文献

附录

附录1 附图

附录 2 文献综述