黑曲霉α-葡萄糖转苷酶的产酶条件、纯化及其性质研究

摘要

该实验室筛选到的一株黑曲霉(Aspergillus niger)M-1,能产生活性较强的α-葡萄糖转苷酶.本研究以黑曲霉M-1为出发菌株,对其α-葡萄糖转苷酶的产酶影响因素、纯化、酶学性质以及必需基团进行系统的研究,结果如下:通过对影响黑曲霉M-1产α-葡萄糖转苷酶的单位因素分析,得液态发酵生产α-葡萄糖转苷酶的最适产酶条件为:4﹪A,2﹪B和1﹪G;在33℃,起始pH值为6.5,转速为140r/min,接种量为6﹪,装液量100mL条件下,发酵4.0d,酶活力达296.05U/mL,添加0.1mmol/L的酶作用底物甲基-α-D-葡萄糖苷对产酶的诱导作用最大.通过硫酸铵分极分离,DEAE-cellulose52、DEAE-sepharose CL-6B和Sephadex G-100柱层析,SDS-PAGE等,从黑曲霉M-1酶提取液中分离纯化得到α-葡萄糖转苷酶,分子量约为110kDa.通过以甲基-α-D-葡萄糖苷为底物,对该酶的部分性质进行了研究.在一定条件下分别以对氯汞苯甲酸(pCMB)、巯基乙醇(ME)、乙基替(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、一氯乙酸(ClAc)、乙酰丙酮、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)等化学修饰剂对α-葡萄糖转苷酶的几种氨基酸残基进行选择修饰,并测定其酶活力变化.

目录

文摘

英文文摘

第一章综述

1.1 α-葡萄糖转苷酶的研究现状及进展

1.1.1 α-葡萄糖转苷酶的理化性质

1.1.2 α-葡萄糖转苷酶检测方法

1.1.3 α-葡萄糖转苷酶在细胞中的分布

1.1.4 α-葡萄糖转苷酶的化学构成与结构

1.1.5 α-葡萄糖转苷酶的催化机制

1.1.6 α-葡萄糖转苷酶的生物学功能

1.1.7 α-葡萄糖转苷酶的产生来源

1.2 α-葡萄糖转苷酶的应用及其前景展望

1.2.1 α-葡萄糖转苷酶主要用于生产低聚异麦芽糖

1.2.2其它方面的应用

1.3本课题的立题背景、意义与主要内容

1.3.1立题背景与意义

1.3.2主要研究内容

第二章α-葡萄糖转苷酶产酶条件的研究

2.1材料与仪器设备

2.1.1材料与试剂

2.1.2仪器设备

2.2实验方法

2.2.1培养基

2.2.2菌体培养

2.2.3粗酶液的制备

2.2.4酶活力的测定

2.3结果与分析

2.3.1 α-葡萄糖转苷酶在细胞中的分布

2.3.2培养基的组成对产酶的影响

2.3.3培养温度对产酶的影响

2.3.4培养起始pH值对产酶的影响

2.3.5培养时间对产酶的影响

2.3.6搅拌速度对产酶的影响

2.3.7接种量对产酶的影响

2.3.8酶作用底物甲基-α-D-葡萄糖苷对产酶的影响

2.4讨论

2.5小结

第三章α-葡萄糖转苷酶分离纯化的研究

3.1材料与仪器设备

3.1.1材料

3.1.2仪器设备

3.2实验方法

3.2.1酶的提取

3.2.2 Bradford检测法测定蛋白质浓度 参照文献[44]

3.2.3酶活力测定

3.2.4硫酸铵分级沉淀 参照文献[44、49、

3.2.5离子交换色谱法 参照文献[44]

3.2.6凝胶过滤层析 参照文献[46]

3.2.7酶纯度的鉴定

3.3结果与分析

3.3.1酶的分离纯化

3.3.2纯化过程小结

第四章α-葡萄糖转苷酶的性质研究

4.1材料与仪器设备

4.1.1材料

4.1.2仪器设备

4.2实验方法

4.2.1分子量测定

4.2.2酶活性中心的化学修饰 参照文献[50-55]

4.2.3 α-葡萄糖转苷酶N-末端氨基酸序列测定

4.3结果与分析

4.3.1纯化酶的部分性质研究

4.3.2酶活性中心的化学修饰

4.3.3 α-葡萄糖转苷酶N-末端氨基酸序列的测定

4.4讨论

4.5小结

第五章总结与展望

5.1总结

5.2展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表学术论文