过表达JHDM2A基因对猪iPSCs诱导效率影响的初步研究

摘要

iPS技术为构建疾病模型、研制评估新药、基因治疗及再生医学等研究奠定了基础，是干细胞研究领域的里程碑。猪在生理及体型上与人相似，因此研究猪的iPS细胞意义重大。但目前猪成纤维细胞诱导为iPS的重编程效率不足1％。研究发现，组蛋白H3K9甲基化阻碍体细胞重编程，降低H3K9甲基化水平可促进iPS诱导。组蛋白甲基化水平受组蛋白甲基转移酶与组蛋白去甲基化酶共同调节。JHDM2A，即JmjC结构域组蛋白去甲基化酶2，可使H3K9me1/2发生去甲基化。过表达JHDM2A基因可促进与ESCs融合的小鼠NSCs重编程为iPS，促进iPSCs诱导;还可调节胚胎干细胞的自我更新。本研究首先采用DOX诱导型的慢病毒载体体系，诱导获得猪多能干细胞（piPSCs），在此基础上通过过表达JHDM2A基因，探究组蛋白H3K9me1/2甲基化水平对猪iPSCs诱导效率的影响，并对其分子机制进行初步探究，以便为进一步提高iPSCs诱导效率、建立大家畜ESCs系奠定基础。本研究主要结果如下:
　　1、猪JHDM2A基因克隆及其表达载体构建
　　根据NCBI上公布的猪JHDM2A基因序列，设计特异性扩增引物，克隆得到猪JHDM2A基因，其编码区长度为3945 bp，编码1315个氨基酸。多重氨基酸序列比对发现，猪JHDM2A基因与黄牛、水牛、绵羊和人相应氨基酸序列的同源性分别为93.5％、94.7％、94.7％、93.8％。蛋白质分子系统进化树分析结果表明，JHDM2A基因在物种进化过程中高度保守。免疫组化结果显示，JHDM2A蛋白在不同发育阶段猪卵泡中均有表达。进一步构建并验证了pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A真核表达载体。
　　2、过表达JHDM2A基因对猪iPSCs形成及相关基因表达的影响
　　首先利用DOX诱导型慢病毒载体体系，将OSKM因子组合导入猪成纤维细胞，将其诱导为iPSCs，在此基础上过表达JHDM2A基因，并分别对获得的iPSCs进行鉴定。
　　当过表达JHDM2A基因时，细胞在第3d出现形变，第8d形成piPSCs克隆，分别比未处理组提前了1d、2d。AP检测阳性克隆数结果发现，与未处理组相比，过表达JHDM2A基因实验组的诱导效率提高了8倍，且iPSCs克隆大小更均匀、边缘更整齐、细胞更致密，AP染色着色更深。RT-PCR分析结果显示，所检测的三种细胞均表达Klf4、c-Myc、Nanog多能性基因，弱表达Sox2基因;过表达JHDM2A实验组和未处理组的piPSCs均表达Oct4，而PFF弱表达表达Oct4。定量PCR结果显示,与未处理组相比，过表达JHDM2A实验组piPSCs多能性基因Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog表达显著升高(P＜0.05)，其中对Oct4的表达影响极显著(P＜0.01)。去DOX后，过表达JHDM2A实验组细胞中的外源基因沉默，内源性Oct4基因表达逐代几乎没有变化，Sox2、Nanog基因表达逐代降低，Klf4、c-Myc基因表达先升高后降低。与未处理组和PFF相比，过表达JHDM2A实验组piPSC组蛋白甲基化基因Tcl1的表达显著提高(P＜0.05)，Tcfcp2L1和Zfp57的表达显著降低(P＜0.05)
　　以上结果表明，克隆获得了猪JHDM2A基因并构建了其慢病毒表达载体，过表达JHDM2A基因可通过调控组蛋白甲基化水平提高piPSCs的诱导效率。

目录

声明

摘要

中英文缩略词对照

第一部分 文献综述

1 iPS的研究进展

1．1 iPS概述

1．2 iPS的诱导

1．3 iPS的形成机制

1．4 iPS的传代

1．5 iPS的鉴定

1．6 iPS面临的问题

1．7 iPS的应用

1．8 猪iPS的研究进展

2 JHDM2A基因的研究进展

2．1 Jmjd家族简介

2．2 JHDM2A基因简介

2．3 JHDM2A的功能

3 表观遗传修饰与iPS的关系研究进展

3．1 DNA去甲基化与iPS的关系研究进展

3．2 组蛋白去甲基化与iPS的研究进展

3．3 JHDM2A与iPS的关系研究进展

4 研究目的与意义

第二部分 试验部分

第一章 猪JHDM2A基因克隆及表达载体构建

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与分析

4 小结

第二章 过表达JHDM2A基因对猪iPSCs形成及相关基因表达的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与分析

4 小结

全文总结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文