细胞自噬调控对兔iPSCs形成及相关基因表达的影响初步研究

摘要

异位表达多能性因子诱导产生多能干细胞(induced pluripotent stemcells，iPSCs)技术为体细胞重编程研究开辟了一条新的途径，不仅可避免伦理争议，还为干细胞及再生医学研究提供了新的研究方法。此外，iPSCs技术也是研究基因表达调控、蛋白质相互作用、机体生长发育的重要手段。目前，有关人的iPSCs研究已经取得许多进展，但对体细胞重编程机理尚不完全了解，离应用还有一定距离，仍需利用动物模型进行更深入的研究。兔的iPSCs在形态上与人iPSCs类似，这使得兔iPSCs相关研究成为关注的热点。本研究采用四环素(Doxycycline，DOX)诱导型的慢病毒载体携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc4个多能性转录因子，将仔兔皮肤成纤维细胞(REFs)重编程为诱导多能干细胞(RiPSCs)，并对内源多能性因子表达及细胞多能性进行分析，并利用雷帕霉素(Rapamycin)调控细胞自噬，观察其对诱导体细胞重编程效率及相关基因表达的影响，以便为提高RiPSCs重编程效率、改善RiPSCs细胞状态奠定基础。
　　1、兔iPSCs的诱导:通过慢病毒感染方法，将携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc4个转录因子的病毒转入REFs并加入DOX诱导其表达。结果发现，诱导2天后，细胞形态开始出现变化，一周后形成克隆。RiPSCs克隆边缘整齐、折光性强、与周围细胞界限明显，细胞排列紧密、核质比增加。形成的RiPSCs克隆碱性磷酸酶(AP)检测结果为阳性;RT-PCR结果显示其表达内源性的Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog基因;细胞免疫荧光检测结果表明，形成的RiPSCs克隆表达Oct4、Sox2、Stat3、Ssea1，未检测到E-cadherin表达。挑取了约150株克隆进行传代培养，有6株可传至20代以上并保持原有的克隆形态及多能性。
　　2、细胞自噬调控对iPSCs诱导过程中相关基因表达及iPSCs形成的影响。探讨了不同浓度雷帕霉素处理对REFs诱导过程中自噬相关基因表达及RiPSCs形成的影响。诱导前3天添加不同浓度的雷帕霉素，待克隆形成后统计碱性磷酸酶(AP)阳性克隆数并观察克隆形态。结果发现，雷帕霉素处理的较适浓度为0.5nmol·L-1。qRT-PCR检测结果显示，0.5nmol·L-1雷帕霉素处理后，除了ATG5在整个诱导过程中稳定表达之外，其余3个自噬相关基因ATG7、LC3、ULK1的表达水平在诱导过程中均有提高（P＜0.05），但升高的程度及表达时间有所不同;Oct4、Sox2、K1f4多能性基因的表达水平显著提高（P＜0.05）。雷帕霉素处理后，RiPSCs的AP阳性克隆数显著增加，且克隆形态有所改善。
　　以上结果表明，DOX慢病毒载体诱导体系可将兔成纤维细胞诱导为iPSCs，获得的RiPSCs具有多能性。调控细胞自噬可在一定程度上提高RiPSCs诱导效率。

目录

声明

摘要

第一部分 文献综述

1 iPSCs的研究进展

1．1 iPSCs概述

1．2 iPSCs的诱导因子

1．3 iPSCs的应用

1．4 iPSCs的优缺点

2 细胞自噬的研究进展

2．1 细胞自噬简介

2．2 mTOR是细胞内营养状态的传感器

2．3 mTOR是细胞应激和生长因子信号的传感器

2．4 哺乳动物的ATG1复合物

2．5 ULK复合物磷酸化的mTOR调节

3 细胞自噬与干细胞的联系

3．1 多能性转录因子与细胞自噬

3．2 胚胎干细胞中的自噬

4 研究目的与意义

第二部分 试验部分

第一章 兔iPSCS的诱导及鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与分析

4 小结

第二章 促进自噬对RiPSCs形成及相关基因表达的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与分析

4 小结

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表学术论文