谷氨酸棒状杆菌高产谷氨酰胺突变株的选育与发酵条件的优化

摘要

L-谷氨酰胺是一种条件必需性氨基酸，它是一种重要的营养物质也是一个极有发展前途的药物。在临床上主要用于消化道溃疡和脑神经功能疾病的治疗。世界上谷氨酰胺的主要生产国是日本，韩国也有少量生产，均采用发酵法。1977年日本就已开始采用发酵法，到20世纪90年代中期其发酵水平达到60g.L-1，韩国的发酵水平为50g.L-1。国内目前尚无一家企业生产药用谷氨酰胺。所以我们首先以一株谷氨酸高产的谷氨酸棒状杆菌为出发菌株，用亚硝基胍(NTG)选择较低的杀菌率范围对其进行3次诱变，并选用结构类似物磺胺胍(SG)、甲硫氨酸亚砜(MSO)筛选出具有双重抗性标记的谷氨酰胺高产菌株C.glutamicumNSM-25。其谷氨酰胺最高产量为17.90g.L-1，比出发菌株的产量(9.69g.L-1)高出84.8％。突变株具有较好的遗传稳定性。对此突变株的生理生化特征、培养条件了进行研究。采用单次单因子法的非统计优化技术发现使用NH4NO3比NH4Cl更适作为无机氮源。合适的250mL摇瓶培养条件为调节培养温度为30℃，初始pH为7.2，接种量为10％，种龄为12h，装液量为30mL。添加氧载体正十六烷的实验表明其能促进C.glutamicumNSM-25的谷氨酰胺的合成，说明溶氧对谷氨酰胺的合成具有重要意义。利用Plackett-Burman法从葡萄糖、尿素、NH4NO3、MgSO4、MnSO4、FeSO4和ZnSO4的浓度七个因子中筛选出尿素、NH4NO3和ZnSO4的浓度三个因子对产胺的影响较大。采用响应面法对影响产胺的重要因子进行了优化，发现用于优化实验的三个独立变量尿素、NH4NO3和ZnSO4都是在降低浓度的情况有利于谷氨酰胺的生成，其中NH4NO浓度对C.glutamicumNSM-25的产谷氨酰胺水平有显著的影响。

目录

文摘

英文文摘

第1章前言

1.1谷氨酰胺的结构和理化性质

1.2谷氨酰胺的生理作用

1.2.1谷氨酰胺的代谢

1.2.2谷氨酰胺的营养

1.2.3谷氨酰胺的抗氧化作用

1.3谷氨酰胺的应用

1.3.1谷氨酰胺在食品方面的应用

1.3.2谷氨酰胺在运动产品中的应用

1.3.3谷氨酰胺在严重手术创伤中的应用

1.3.4谷氨酰胺在临床医学和药物方面的应用

1.4谷氨酰胺的生物合成与代谢调控

1.5目前国内外谷氨酰胺生产的研究进展

1.5.1谷氨酰胺的生产方法

1.5.2发酵法生产谷氨酰胺的研究进展

1.6谷氨酰胺的分析检测

1.7谷氨酰胺的提取工艺

1.8本论文的选题意义

第2章材料和方法

2.1菌种

2.2试剂

2.2.1化合物

2.2.2测还原糖试剂

2.3培养基

2.4仪器

2.5实验方法

2.5.1谷氨酰胺的测定——纸层析法

2.5.2残糖的测定——DNS法

2.5.3谷氨酰胺棒状杆菌生物量的测定

2.5.4菌种的诱变

2.5.5定义

2.5.6高产突变株遗传稳定性的检验

2.5.7高产突变株谷氨酰胺合成条件的初步优化

2.5.8高产突变株谷氨酰胺合成条件的统计优化

2.5.9 5-L发酵罐中谷氨酰胺合成过程的优化

第3章结果与讨论

3.1菌种的诱变

3.2高产突变株C.glutamicum NSM-25的遗传稳定性

3.3出发菌株和突变菌株的生长曲线及产谷氨酰胺曲线

3.4 C.glutamicum NSM-25谷氨酰胺合成条件的初步优化

3.4.1不同碳源对C.glutamicum NSM-25生长和谷氨酰胺产量的影响

3.4.2不同氮源对C.glutamicum NSM-25生长和谷氨酰胺产量的影响

3.4.3玉米浆浓度对C.glutamicum NSM-25生长和谷氨酰胺产量的影响

3.4.4初始pH对C.glutamicum NSM-25生长和谷氨酰胺产量的影响

3.4.5接种量对C.glutamicum NSM-25生长和谷氨酰胺产量的影响

3.4.6种龄对C.glutamicum NSM-25生长和谷氨酰胺产量的影响

3.4.7装液量对C.glutamicum NSM-25生长和谷氨酰胺产量的影响

3.4.8氧载体对C.glutamicum NSM-25生长和谷氨酰胺产量的影响

3.5 C.glutamicum NSM-25谷氨酰胺合成条件的统计优化

3.5.1 Plackett-Burman实验设计法

3.5.2中心组合设计法

3.6 5-L发酵罐中谷氨酰胺生物合成过程的优化

第4章结论

参考文献

致 谢

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