斜带石斑鱼胃蛋白酶原和几丁质酶基因的克隆与表达研究

摘要

斜带石斑鱼在东南亚和中国南部，是重要经济海水鱼种之一。斜带石斑鱼具有巨大的经济价值，国内外有不少学者对其进行研究报道，但对其消化生理，尤其是消化酶的分子生物学研究，目前还没有报道。本论文以斜带石斑鱼胃蛋白酶原和几丁质酶为对象，主要研究结果如下： 1、应用CloneMiner重组技术构建了胃组织cDNA文库，库容量为5.6×106 cfu/ml。随机挑取512个克隆测序，获得293个EST序列。其中69.97％ESTs在GenBank蛋白质数据库中找到同源性较高的序列，这些ESTs编码的蛋白按生物功能可分能量代谢、消化酶类、蛋白合成、细胞信号传导、转录和未知功能蛋白等10种类型，包括了16条胃蛋白酶相关EST序列和68条几丁质酶相关EST序列。该文库保留了胃组织分子生物学信息，为克隆胃组织中功能基因和研究斜带石斑鱼消化生理的分子机制奠定了基础。 2、本研究克隆的胃蛋白酶原C、A1和A2全长cDNA序列分别为1485bp、1764bp和1314bp，开放阅读框分别编码387个、376个和377个氨基酸；信号肽预测，均在Gly16-Ile17位为信号肽切割位点；酶原激活位点预测分别在Phe53-Tyr54、Tyr45-Pro46和Phe45-Pro46位点。胃蛋白酶原A1、A2和C基因序列均由8个长度不一的内含子和9个外显子构成，长度分别为3.0kb、2.3kb和3.4kb。Northern blot分析表明胃蛋白酶原C、A1和A2基因分别有3个、2个和3个转录本。对斜带石斑鱼与鱼类酸性蛋白酶氨基酸序列的同源性比较和进化树分析结果显示，胃蛋白酶原C、A1和A2基因都属于鱼类天冬酸蛋白酶中的胃蛋白酶原家族。 对胃蛋白酶原在斜带石斑鱼成体各组织和不同发育时期的表达情况的分析结果显示，胃蛋白酶原A1 mRNA仅在胃中表达，胃蛋白酶原A2则在胃和中肠都有表达，而胃蛋白酶原C mRNA除了在胃中，还在肠、幽门垂、食管、鳃和性腺中检测到。本研究结果首次发现鱼类胃蛋白酶原C和A2 mRNA在胃以外的非酸性环境的组织中表达，提示胃蛋白酶C和A2除了有分解底物中蛋白的功能外，很可能还有其它的生理功能。 胃蛋白酶原C和A2 mRNA自受精卵和出膜后1天，就可持续被检测到表达，并在出膜后29天表达量显著增高；胃蛋白酶原A1在出膜后29天才检测到有mRNA表达。结果提示，胃蛋白酶原C、A1和A2按次序性表达的模式，可能与斜带石斑鱼不同发育时期需要种类和数量不同的酶来消化各种食物中的蛋白有关。 3、本研究克隆的几丁质酶1和2 cDNA序列全长分别为1658bp和1764bp，开放阅读框长度分别为1434bp和1485bp，编码477个和494个氨基酸，前21个氨基酸组成了信号肽，第22位氨基酸之后是成熟肽。氨基酸序列分析显示这两种基因都有典型的18家族几丁质酶结构区域特征，含有glyco-18区域、2型几丁质结合区域、酶催化活性位点和一个铰链区域。几丁质酶2的铰链区域具有脊椎动物酸性几丁质酶的特征性序列，即丝氨酸和甘氨酸(S—G)重复序列；而在几丁质酶1氨基酸序列中含有一段特征性的颉氨酸、天冬酰胺和脯氨酸重复序列(NVNPPVNPNVNP)。对斜带石斑鱼与其它脊椎动物几丁质酶氨基酸序列的同源性比较和进化树分析结果显示，斜带石斑鱼几丁质酶1和2分别与日本比目鱼酸性几丁质酶1和2的同源性最高，而且都处于同一分枝上，属于酸性几丁质酶大类。 4、利用表达载体pET3c—sumo建立了几丁质酶1和2成熟肽的原核表达系统，分别在大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达，获得了分子量约62.7kDa和63.8kDa的含有sumo和His—tag标签的融合蛋白几丁质酶1和2，绝大部分以包涵体形式表达。通过纯化包涵体，利用SUMO酶酶切去除sumo和His—tag标签，再经Ni—NTA Resin亲和纯化分离出纯度为94％的单体蛋白几丁质酶1或2；并作为抗原分别免疫新西兰大白兔，抗血清经过硫酸铵沉淀纯化，获得了没有免疫交叉反应、高特异性的兔抗几丁质酶1和2多克隆抗体。 5、根据几丁质酶1和2核苷酸序列设计特异性引物，以及应用本研究制备的多克隆抗体，利用RT—PCR和Western blot方法进行时空表达分析，结果显示几丁质酶1和2在不同组织中和发育时期均只有一种表达形式。几丁质酶1和2 mRNA在胃、中肠、脾脏和肾脏、皮肤中检测到。但在蛋白水平，几丁质酶1只在胃和脾脏中有表达，而几丁质酶2表达仅限于胃。随着斜带石斑鱼仔、稚、幼鱼的发育，几丁质酶1在刚出膜即可检测到有mRNA和蛋白低水平、持续表达，出膜后35天，mRNA表达量有所增高，而蛋白表达量到了65天才明显上升。几丁质酶2在出膜后第5天才检测到有mRNA转录表达，直至出膜后65天才检测到有蛋白表达。 免疫组织化学实验结果显示，在胃体部中胃腺的峡部、颈部和底部都有几丁质酶1和2免疫阳性反应，其中几丁质酶1在底部的免疫阳性细胞分布密度比几丁质酶2较高；在脾脏检测到几丁质酶1免疫阳性细胞，但未检测到几丁质酶2免疫反应性。 以上结果提示，几丁质酶1和2的表达都是翻译水平调控，但调控机理有所不同；两者的生理功能有异同，除了参与食物消化外，几丁质酶1很可能还参与自身防御、免疫活动等生理过程，在仔鱼和稚鱼发育阶段也可能参与十分重要的生理活动。 6、构建了毕赤酵母表达载体pPIC3.5k、pPICZαA和pPGAPZαA，构建了几丁质酶1和2成熟肽的表达质粒，并获得了胞内表达重组几丁质酶1和2、组成型分泌表达重组几丁质酶1以及诱导型分泌表达重组几丁质酶2的GS115重组菌株，结果显示毕赤酵母胞内表达的重组几丁质酶1和2水解可溶性几丁质酶的酶活力分别为59.1U和56.2U；分泌表达重组几丁质酶1和2的表达上清都具有较高的水解可溶性和胶状几丁质的活性，酶活力分别为327.1U和89.3U，以及127.6U和80.4U。结果提示，胞内表达重组几丁质酶1和2的毕赤酵母菌株和分泌表达的重组几丁质酶1和2。 7、酶活性分析表明，胃组织中天然几丁质酶水解可溶性和胶状几丁质的酶活力分别为141.6U和58.1U，纯化后分别为12.8U和6.2U。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

1.cDNA文库和EST在鱼类基因克隆中的应用

2.胃蛋白酶原的研究进展

3.几丁质酶的研究进展

4.本研究的目的和意义

5.本研究的创新点

第一章斜带石斑鱼胃cDNA文库构建和序列信息学初步分析

1.1材料

1.2方法

1.3结果

1.4讨论

1.5小结

第二章胃蛋白酶原A1、A2和C基因的克隆、时空表达和酶活性分析

2.1实验材料

2.2方法

2.3结果

2.4讨论

第三章斜带石斑鱼两种几丁质酶基因的克隆及其时空表达分析

3.1实验材料

3.2方法

3.3结果

3.3.1斜带石斑鱼几丁质酶1和2的5'RACE实验结果

3.3.2几丁质酶1和2基因全长cDNA序列的获得

3.3.3几丁质酶1和2氨基酸序列分析和结构域预测

3.3.4RT-PCR引物特异性验证

3.3.5几丁质酶1和2mRNA水平时空表达

3.3.6新表达质粒NpET3c-SUMO的构建

3.3.7重组表达质粒pET3c-ch1和pET3c-ch1的构建

3.3.8几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达研究

3.3.9几丁质酶1和2多克隆抗体的制备，效价及特异性检测

3.3.10多克隆抗体的免疫组织化学鉴定

3.3.11几丁质酶1和2蛋白水平的时空表达

3.3.12两种几丁质酶在斜带石斑鱼胃和脾脏中的分布

3.4讨论

第四章斜带石斑鱼两种几丁质酶基因在毕赤酵母中的表达及其与天然几丁质酶活性的比较分析

4.1材料

4.2方法

4.3结果

4.3.1诱导型分泌表达质粒pPICαA-ch1和pPICZαA-ch2的构建和表达

4.3.2组成型分泌表达质粒pGAPZαa-ch1和pGAPZαa-ch2的构建和表达

4.3.3诱导型胞内表达质粒pPIC3.5k-ch1和pPIC3.5k-ch2的构建和表达

4.3.4胃组织中几丁质酶的纯化

4.3.5胃组织几丁质酶和酵母表达重组几丁质酶的活力检测

4.4讨论

总 结

参考文献

附 录

致 谢