一种作为饲料添加剂的斜带石斑鱼几丁质酶1的发酵方法

摘要

本发明公开了一种作为饲料添加剂的斜带石斑鱼几丁质酶1的发酵方法。本发明斜带石斑鱼几丁质酶1的发酵方法是将含有斜带石斑鱼几丁质酶1的重组表达载体的菌种上发酵罐，通过在线控制pH、溶氧、转速、补料方式、诱导剂流加速度等参数，得到表达量高、酶活性高的重组斜带石斑鱼几丁质酶1。本发明方法制备得到的重组斜带石斑鱼几丁质酶1为胞内表达重组蛋白，存在于酵母细胞内，酵母细胞对蛋白起到一定的保护作用，降低了蛋白酶的水解作用，作为饲料添加剂可以直接添加到饲料中，不必纯化蛋白，适合商业化生产应用。

说明书

技术领域

本发明涉及斜带石斑鱼蛋白的制备领域，具体涉及一种作为饲料添加剂的斜带石斑鱼几丁质酶1的发酵方法。

背景技术

优质的促生长饲料添加及能否开发成功有赖于鱼类生长调控及消化和营养吸收的相关基因及基因产品应用的关键技术的研究。国内外水产动物的非营养性添加剂，除了药物添加剂应用较多外，其它使用较少。目前非营养性添加剂的研究开发已引起重视，主要应用的有微生态制剂、酶制剂、诱食剂、促生长剂等，都是天然产物或人工合成的化学产品，还未见以基因工程方法生产以几丁质酶为主要成分的鱼类饲料添加剂产品。脊椎动物几丁质酶分为三类：巨噬细胞特异性几丁质酶，酸性几丁质酶和胰腺特异性几丁质酶。目前鱼类几丁质酶功能的研究显示分布于胃的酸性几丁质酶主要作用于消化，而鱼类中是否存在巨噬细胞特异性几丁质酶和胰腺特异性几丁质酶并具有免疫相关的功能则仍需进一步研究。氨基寡糖可以增进鱼类的消化和营养吸收，提高免疫力，促进鱼体的健康生长。因此，利用巴斯德毕赤酵母重组表达几丁质酶，一方面可以直接作为饲料添加剂，直接刺激鱼体内氨基寡糖的生成，促进鱼体的生长，提高免疫力。另一方面，开发的重组几丁质酶可作为酶制剂产品，用于对甲壳类和下杂鱼中几丁质的降解，获得更高价值的氨基寡糖产品。

石斑鱼是海洋珊瑚礁鱼类，属鮨科(Serranidae)，石斑鱼属(Epinephelus)，有30多种。石斑鱼是一种名贵的海水鱼类，具有极高的经济价值。石斑鱼的苗种培育是养殖生产持续发展的关键，但目前在石斑鱼人工养殖中还没有一种能有效促进其苗种生长的饵料添加剂。

发明内容

本发明的目的在于根据现有的鱼类蛋白在饲料添加剂中的应用较少，开发不全面的问题，提供一种表达量高、酶活性高的斜带石斑鱼几丁质酶1的发酵方法。

本发明目的通过以下技术方案予以实现：

一种作为饲料添加剂的斜带石斑鱼几丁质酶1的发酵方法，是将含有斜带石斑鱼几丁质酶1的重组表达载体上发酵罐，通过在线控制pH、溶氧、转速、补料方式、诱导剂流加速度等参数，得到表达量高、酶活性高的重组斜带石斑鱼几丁质酶1。

本发明发酵方法具体包括如下步骤：

(1)种子培养：将含有斜带石斑鱼几丁质酶1的重组表达载体在酵母膏蛋白胨葡萄糖琼脂培养基YPD上培养，挑取单克隆于最小甘油培养基MGY中继续培养后接种，作为上罐种子液；

(2)生物量的累积：将种子液加入有培养液的发酵罐中培养，加入甘油扩增培养菌体，甘油消耗完则补加含有微量元素混合液PTM1的甘油，至菌体湿重达180～220g/L时，停止补加甘油，溶解氧值接近100％时，继续维持无甘油状态25～35min；

(3)甲醇诱导：甲醇中加入含有微量元素混合液PTM1，混匀，加入到发酵罐中诱导表达，72～96h后结束发酵，离心收集菌体，破碎提取胞内蛋白，得到斜带石斑鱼几丁质酶1。

其中，步骤(2)中所述发酵罐培养所用的培养液是无机盐培养液BSM，在28℃下用28％(v/v)的氨水调节培养液pH至5.0，加入含有微量元素混合液PTM1；所述含有微量元素混合液PTM1的添加量为4～5mL/L BSM培养液。

作为一种优选方案，加入甘油扩增培养菌体时，发酵罐参数设置为：搅拌速度500～800rpm，罐内压力为9psi，温度为28℃，溶解氧值在20体积％以上。

作为一种优选方案，步骤(2)中所述甘油中含有微量元素混合液PTM1的添加量是11～13mL/L甘油；步骤(3)中所述甲醇中含有微量元素混合液PTM1的添加量是11～13mL/L甲醇。

本发明作为饲料添加剂的斜带石斑鱼几丁质酶1的发酵方法所得的斜带石斑鱼几丁质酶1，可以作为鱼类的饲料添加剂，直接加入到含有虾皮粉的基础料中制成成品饲料。该饲料的投喂方法可以是每天早晚两次定时足量投喂，为保证酶活性，饲料室温放置最好不要超过一周，大批饲料应4℃保存。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)通过本发明发酵方法制备得到的斜带石斑鱼几丁质酶1为胞内表达重组蛋白，存在于酵母细胞内，由于酵母细胞壁较厚，对蛋白起到了一定的保护作用，还可降低蛋白酶的水解作用，因此可以添加到饲料中；

(2)本发明方法适于高效生产高质量的饲料添加剂，制得的斜带石斑鱼几丁质酶1表达量、酶活性高。

附图说明

图1是投喂斜带石斑鱼几丁质酶1经过8周后，斜带石斑鱼体重的变化；

图2是不同浓度的斜带石斑鱼几丁质酶1对下丘脑NPY mRNA表达量的影响；

图3是不同浓度的斜带石斑鱼几丁质酶1对下丘脑Orexin mRNA表达量的影响；

图4是不同浓度的斜带石斑鱼几丁质酶1对垂体GH mRNA表达量的影响；

图5是不同浓度的斜带石斑鱼几丁质酶1对下丘脑GHRH mRNA表达量的影响；

图6是不同浓度的斜带石斑鱼几丁质酶1对溶菌酶活力的影响；

图7是不同浓度的斜带石斑鱼几丁质酶1对超氧化物歧化酶活力的影响；

图8是不同浓度的斜带石斑鱼几丁质酶1对谷草转氨酶活力的影响。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1利用5L发酵罐发酵生产斜带石斑鱼几丁质酶1重组菌株pPICZαA-ch1/GS115

(1)种子培养

①将-80℃冻存的工程菌pPICZαA-ch1/GS115在YPD平板上(含G4180.5mg/ml)划线，28℃培养；

②培养72h左右，挑取单克隆于5ml MGY培养基(种子培养基)中，28℃，250r/min，振荡培养16～24h；

③取100μl上述种子液接种于100ml MGY培养基(500ml的锥形瓶)中，共3瓶，28℃，250r/min，12～14h，至OD600＝2～6，作为上罐种子液。

(2)生物量的累积

①调校设备：校准发酵罐的pH电极、溶氧电极(在28℃时进行)，并进行蠕动泵的流量校准；

②配制3L BSM培养液，加入5L发酵罐，121℃，30min高压灭菌培养基、发酵罐及管道；

③待发酵罐内培养液冷却到28℃时，用28％氨水调节BSM培养基的pH值至5.0，而后按照4.35mlPTM1/L BSM的比例加入PTM1微量元素；

④将上述MGY培养菌种加入发酵罐中，开始发酵罐培养，此为第一阶段即甘油培养扩增菌体，发酵罐参数设置分别为搅拌速度500～800r/min，罐内压力9psi，温度28℃，设定DO值(溶解氧)在20％以上，以P-I-D方式控制；

⑤此阶段每间隔12h取样1次，测OD600值和菌体湿重，此时菌体湿重约为90～150g/L；

⑥当DO值上升至接近100％(约30h)，说明培养液中甘油已消耗殆尽，转入补充甘油阶段以进一步增加菌体密度；

⑦按照每升12ml PTM1微量元素的比例在高压灭菌后的50％甘油中加入PTM1微量元素，混匀后，以18.2ml/h/L的速率加入到发酵罐中，至菌体湿重达180～220g/L；

⑧停止补加甘油后，观测DO值上升至接近100％后，继续维持“甘油饥饿”状态30min，转入甲醇诱导表达阶段。

(3)甲醇诱导斜带石斑鱼几丁质酶1的表达

①按照12ml/L比例在甲醇中加入PTM1微量元素，混匀后，以3.6ml/h/L的速率加入到发酵罐中诱导表达，维持此低速率2～3h，以使酵母适应以甲醇为唯一碳源的环境。在此期间，DO值变得不稳定，波动较大，在酵母适应环境后，DO值即保持稳定，继续维持此低速率补加甲醇2h；

②补加甲醇的速率升为7.3ml/h/L，以此速率维持2h；

③升高补加甲醇的速率为8.0ml/h/L，同时监测DO值和发酵液温度并判断甲醇是否过量(停补甲醇观测DO值变化，若停补甲醇后，DO值在1min内上升幅度大于10％，说明碳源受限，反之说明甲醇过量)，若碳源不足，则加快补甲醇的速率，若甲醇过量，则应调慢补甲醇的速率，直到合适的速度；

④开始诱导表达后，每隔12h取样1次，测OD600值和菌体湿重，分析酵母菌生长状态，肉眼和镜下观察菌液，确认无杂菌污染，并留菌体用于蛋白分析；

⑤诱导发酵72h后，结束发酵。4500rpm，15min离心，收集菌体，-20℃保存；留取少量上清，-80℃保存，以备后续检测使用。发酵结束菌体湿重可达450g/LBSM。

实施例2重组斜带石斑鱼几丁质酶1活性鉴定

取2g研磨好的虾皮粉，加入10ml丙酮，静置1h，加入40ml 4℃预冷的HCl终止水解，然后加入50ml 100％乙醇，充分搅拌，30min后，将其离心，沉淀用25ml PBS(pH 2.5)洗三次，最后将沉淀溶于10ml PBS(pH 2.5)，-20℃备用。取发酵所得工程菌加入适量PBS重悬菌体，利用玻璃珠破碎法提取胞内蛋白。取上述虾皮几丁质提取液0.2ml、0.1m1蛋白提取液，再加入0.2ml PBS(pH 2.5)混匀，28℃，震荡反应1h，加入0.5ml DNS，100℃，10min，5000rpm离心1min，540nm进行分光光度测活。以不同浓度的N-乙酰葡萄糖氨为标准品做标准曲线。最后测的上述发酵所得重组几丁质酶的活性为75.9U。

实施例3重组斜带石斑鱼几丁质酶1对斜带石斑鱼生长的影响

用酵母胞内表达的斜带石斑鱼几丁质酶1对石斑鱼幼鱼进行投喂实验，检测不同浓度的重组斜带石斑鱼几丁质酶1对摄食、生长等宏观指标的影响。实验饲料共设几丁质酶添加水平4个，分别为0、5μg/g、10μg/g、20μg/g(几丁质酶/饲料)，其中添加剂量为0的对照组添加空载酵母，每组设3个重复，实验鱼桶共15，每桶放20尾鱼作为一个样本，以随机化区组配置法编号分组。养殖实验开始前停食24h，然后分别测量鱼的体重(结果见表1)，方差分析表明，各组之间初始鱼体重没有显著差异。实验结束时停食24h分别测量鱼的体重，得到增重量(结果见表1-1、图1-2)。每日二次定时(08:30；17:00)定量投饵，保证饱足，投喂期为56天。投喂1h后，收集残饵于100目筛绢袋中。实验前测定饲料含水量和饲料溶失率，以计算投饵干重和净摄食干重。摄食生长试验时间为2009年6月1日-2009年7月26日，历时56天。

表1斜带石斑鱼几丁质酶1对斜带石斑鱼各生长指标的影响(平均数±标准误差)

实施例4重组斜带石斑鱼几丁质酶1对斜带石斑鱼生长代谢及摄食相关基因表达的调控

用酵母胞内表达的斜带石斑鱼几丁质酶1对石斑鱼幼鱼进行投喂实验，检测不同浓度的重组斜带石斑鱼几丁质酶1对其生长代谢及摄食相关基因表达的调控。上述投喂实验结束后，将所有实验鱼抽取血液样品，然后断头处死，取下丘脑、垂体等组织样品放入液氮中保存。提取总RNA，用Real-time PCR方法检测目的基因mRNA表达水平。

cDNA第一链的合成：

1)按照NEB公司的DNase I Kit说明书，用DNase I处理样品，去除样品中基因组污染。反应体系如下：

反应条件：37℃，10min。

2)加入1μl的EDTA灭活DNase I，75℃，10min。

3)根据TOYOBO公司的First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书进行反转录。反应体系如下：

反应条件：42℃，30min；99℃，5min；4℃，5min。

标准曲线的建立：

以RT产物为模板，用目的基因检测的引物(1.5)扩增得到的片段连接入T载体中，制备感受态，转化，提取质粒，胶回收。用核酸测定仪测定各质粒的浓度，并以10倍浓度梯度稀释，进行预实验，保证样品的Cp值在标准曲线上。

Real-time PCR的检测：根据TOYOBO公司的SYBR Green Real-time PCRMaster Mix试剂盒说明书进行反应。反应体系如下：

反应条件如下：

94℃    3min

72℃    1min

最后进行溶解曲线分析。

结果如图2～5所示。

实施例5重组斜带石斑鱼几丁质酶1对溶菌酶活力的影响

  空白管  标准管  测定管  蒸馏水(ml)  0.2  -  -  2.5μg/ml溶菌酶标准应用液(ml)  -  0.2  -  血清(ml)  -  -  0.2  应用菌液(ml)  2.0  2.0  2.0

混匀，37℃准确水浴15min，立即取出置于0℃以下的冰水浴中3min，逐管取出倒入1cm光径比色皿中，530nm处以蒸馏水调透光度100％，比色，测各管透光度T₁₅(T₁₅即37℃水浴15min后的透光度值)。结果如图6所示。

实施例6重组斜带石斑鱼几丁质酶1对超氧化物歧化酶活力的影响

混匀，室温放置10min，于波长550nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色。结果如图7所示。

实施例7重组斜带石斑鱼几丁质酶1对谷草转氨酶活力的影响标准曲线的制定：

室温放置10min，505nm，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值，以各管吸光度值减去零管吸光度值，所得差值为纵坐标，相应的卡门氏单位为横坐标，作坐标图。

血清的测定：

室温放置10min，505nm，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值，以测定管吸光度值减去对照管吸光度值之差值，查标准曲线，求得相应的AST/GOT活力单位(图8)。