鳜胃蛋白酶原早期发育表达及两种胃泌素家族基因的克隆与表达

摘要

胃蛋白酶原(Pepsinogen，PG)是胃蛋白酶的前体,在胃酸作用下能够激活成为活性形式的胃蛋白酶。本实验室前期获得了鳜(Siniperca chuatsi)三种胃蛋白酶原 PG A1、PG A2和PG C cDNA全长序列,为进一步了解鳜胃蛋白酶原早期发育表达特征,论文采用荧光定量 PCR技术检测了鳜孵化后0-22天(days post hatching，dph)胃蛋白酶原 mRNA表达水平变化,结果表明,3种胃蛋白酶原 mRNA表达均始于8 dph,之后表达量都呈上升趋势,PG A1表达量最高,其次是 PG A2,PG C表达量最低。它们的表达各具特点,其中,PG A2在16-22 dph表达量比较平稳。三种胃蛋白酶原 mRNA的表达时间都早于胃腺的出现时间(13-14 dph),推测13 dph以前观察到的胃蛋白酶原 mRNA表达可能并不是由胃腺表达的,而是由其它组织表达的。
　　胃蛋白酶作为胃蛋白酶原的活性形式,是消化道中的重要消化酶,是胃内酸性消化的执行者,对食物蛋白质的初步消化起重要作用,胃蛋白酶活性的大小反映了胃的消化能力。在鳜早期发育阶段,胃组织尚未分化发育,此时仔鱼消化主要是依靠胞饮作用进行胞内消化,以及碱性消化作用。随着消化系统的发育,出现了胃和胃腺,胃腺分泌胃蛋白酶原,胃蛋白酶原在胃酸作用下形成活性形式的胃蛋白酶,仔鱼消化方式由碱性消化转变为消化道内更有效的酸性消化。本研究检测了鳜孵化后0-22天胃蛋白酶样活性大小变化,结果显示酶样活性呈现较大的波动,在早期(0-8 dph)就有检测到较低水平的活性,而此时胃腺尚未出现,胃蛋白酶原基因也未表达,这一时期的胃蛋白酶样活性可能是由母源性的胃蛋白酶或其它天冬氨酸蛋白酶所致。8 dph后胃蛋白酶样活性迅速上升,这与胃蛋白酶原 mRNA水平的表达特征一致。
　　胃蛋白酶分泌受多种胃肠激素影响,胃泌素(gastrin，GAS)与胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)对胃蛋白酶原分泌都有一定的调控作用,GAS主要刺激胃酸分泌,CCK主要促进胆囊排空及胰液分泌,鱼类中尚缺乏 GAS、CCK的功能系统研究。论文采用RACE技术克隆了鳜胃泌素与胆囊收缩素基因 cDNA序列,GAS基因 cDNA全长581bp,5’非翻译区100 bp,3’非翻译区145 bp,开放阅读框336bp,编码111个氨基酸;CCK具有2种类型:CCK1与 CCK2,CCK1 cDNA全长为843bp,5’非翻译区60 bp,3’非翻译区369 bp,开放阅读框414bp,编码137个氨基酸;CCK2 cDNA全长846bp,5’非翻译区112bp,3’非翻译区332bp,开放阅读框403bp,编码134个氨基酸。GAS与 CCK成熟肽 C末端具有相似的八肽结构(DYQGWVDF/DYLGWMDF),仅在 C末端第3位和第6位氨基酸发生替换。荧光定量 PCR分析表明，GAS mRNA主要表达于肠和幽门垂,CCK1与 CCK2 mRNA在脑中表达量最高,在肠和幽门垂也有较高表达,表明 GAS与 CCK同为消化调控因子,而 CCK还是重要神经分泌因子。GAS与 CCK mRNA表达贯穿于鳜整个幼体早期发育阶段(孵化后0-22天),前期表达水平较高,后期表达水平较低,并趋于平稳,GAS与 CCK mRNA发育表达水平变化可能与这一时期消化道生长发育旺盛有关。

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引 言

1 鱼类胃蛋白酶原研究进展

1.3.1 胃蛋白酶原基因的组织分布

1.3.2 胃蛋白酶原基因的发育表达

1.5.1 胃蛋白酶原分泌的过程

2 鱼类胆囊收缩素、胃泌素的研究进展

2.1.1 胆囊收缩素的结构和种类

2.1.2 胆囊收缩素的组织分布

2.1.3 胆囊收缩素的功能

2.2.1 胃泌素的结构

2.2.2 胃泌素的组织分布

2.2.3 胃泌素的功能

3 本研究所要解决的问题

4 研究目的与意义

第一章 鳜胃蛋白酶原基因与胃蛋白酶活性早期发育表达

1.1 前言

1.2 材料与方法

1.2.1.1 实验仔鱼

1.2.1.2 取样与处理

1.2.1.3 试剂与耗材

1.2.2.1 总 RNA 的提取与处理

1.2.2.2 总 RNA 质量检测

1.2.2.3 cDNA 合成

1.2.2.4 qPCR 引物设计与合成

1.2.2.5 胃蛋白酶原基因的 qPCR 检测

1.2.2.6 胃蛋白酶活性测定

1.3 结果与分析

1.4 讨论

第二章 鳜胃泌素家族基因克隆及表达研究

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1.1 实验用鱼

2.2.1.2 实验试剂

2.2.1.3 实验仪器

2.2.2.1 总 RNA 提取及质量检测

2.2.2.2 引物设计与合成

2.2.2.3 全长 cDNA 的扩增

2.2.2.4 荧光定量 PCR

2.2.2.5 生物信息学分析

2.3 结果

2.3.5 鳜 GAS 与 CCK mRNA 的早期发育表达

2.4 讨论

小 结

参考文献

硕士期间发表论文

致谢