HBeAg影响人胎盘滋养层细胞TLR3/4表达效应及其在母婴传播中作用机制的研究

摘要

研究背景和目的：
　　 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一种肝向性DNA病毒,严重威胁人类的健康。孕妇感染HBV后,可能经胎盘垂直传播给胎儿,引起宫内感染,是我国人群HBV传播的重要途径。乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)是HBV的一种辅助蛋白,并不参与病毒的复制和组装。HBeAg阳性慢性乙型肝炎(CHB)孕妇常持续感染HBV,并导致宫内感染。研究发现,HBeAg能抑制CHB患者的肝细胞、外周血单核细胞和Kupffer细胞Toll样受体2(TLR2)表达及其介导的天然免疫反应,相似的是,在HBeAg阳性CHB患者的外周血树突状细胞Toll样受体3(TLR3)表达减少。此提示,HBeAg在病毒感染过程中可能起免疫调节作用,促进病毒持续感染。
　　 Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一种近年来新发现的模式识别受体,可识别和应答病原体相关分子模式(PAMPs),在抵御各种病原微生物的免疫应答中发挥重要作用。天然免疫系统是机体抗病原体感染的第一道防线,TLRs家族是其中重要的组成部分。
　　 TLRs可广泛表达于哺乳动物的组织和细胞中。至今,已发现和鉴别了10种人属TLRs,在人胎盘组织均可表达,TLR3、TLR4主要表达于胎盘滋养层细胞。TLRs信号传导包括2条途径:MyD88依赖性和非依赖性途径,TLR3信号传导主要通过MyD88非依赖的TRIF途径,而TLR4主要通过MyDS8依赖性或非依赖性途径传导信号。TZR3、TLR4可介导抑制肝脏细胞、外周血树突状细胞中HBV复制。TLR3可识别病毒双链RNA(dsRNA)并发生免疫应答,滋养层细胞在TLR3的配体多聚肌胞(polyI:C)处理后可产生Ⅰ型干扰素(IFN-α/β),而IFN-β是由TLR3诱导细胞产生的主要细胞因子；以TLR4的配体脂多糖(LPS)刺激绒毛滋养层细胞可产生前炎症细胞因子(如TNF-α)和趋化因子(如IL-8)。此提示,胎盘滋养层细胞可能通过TLR3、TLR4识别病毒相关分子模式并触发抗病毒反应。
　　 胎盘作为一种特殊的物理和免疫屏障,在防御不同微生物的侵袭中起重要作用。胎盘屏障的第一层细胞是滋养层细胞,该层细胞直接与母亲血液接触,可识别病原微生物并对其作出相应的免疫应答。因此,滋养层细胞在防御HBV宫内感染中可能发挥重要的作用。
　　 但是,关于HBeAg阳性CHB孕妇持续感染HBV并导致宫内感染的机制尚不清楚。Bewo细胞是一种人胎盘绒毛癌细胞系,现已被广泛用于滋养层细胞功能的研究。本研究拟分别构建1.3倍HBV基因组及HBeAg的真核表达载体,转染Bewo细胞,建立HBV和HBeAg表达的细胞模型,并以此研究HBeAg对人胎盘滋养层细胞TLR3/4的表达及其生物效应的影响,探讨胎盘HBV持续感染并垂直传播给胎儿的机制,为防治HBV宫内感染提供新的理论和实验依据。
　　 方 法
　　 1.HBeAg阳性慢性乙型肝炎孕妇胎盘组织TLR3、TLR4的表达及意义:选取22例HBeAg阳性和24例HBeAg阴性CHB孕妇,及正常孕妇25例。建立实时荧光定量RT-PCR检测胎盘组织中TLR3、TLR4 mRNA水平,同时以免疫组化法检测其在胎盘组织中的表达,并采用荧光定量PCR(FQ-PCR)和微粒子酶免疫分析法(MEIA)分别定量检测其血清HBV DNA和HBeAg水平。
　　 2.TLR3、TLR4介导的天然免疫对Bewo细胞中HBV复制的作用:以质粒pMD18T-HBV上的HBV DNA序列为模板,构建1.3倍HBV全基因序列基因,将其插入到真核表达载体peDNA3.1(+),用酶切、PCR及测序鉴定,并把该载体转染Bewo细胞,以Western免疫印迹、MEIA和FQ-PCR分别检测胞内和上清中HBsAg、HBeAg的表达及HBV DNA水平。以RT-PCR和ELISA分别检测细胞TRIF、MyD88 mRNA表达及其上清IFN-β、IFN-α水平。
　　 3.HBeAg对Bewo细胞TLR3、TLR4表达及其生物效应的影响:用PCR方法从质粒pMD18T-HBV中扩增HBeAg基因,克隆到peDNA3.1(+),构建真核表达载体peDNA3.1(+)-HBe,通过酶切、PCR及测序鉴定,并把该载体转染Bewo细胞,用Western免疫印迹和MEIA检测胞内和上清中HBeAg的表达。以FQ-PCR和ELISA分别检测细胞TLR3、TLR4 mRNA表达及细胞上清IFN-β、IFN-α水平,并采用免疫荧光染色法检测细胞NF-κBp65核转运。
　　 结 论
　　 1.HBeAg阳性CHB孕妇血清HBeAg持续高表达,且其宫内感染率显著高于正常及HBeAg阴性孕妇,但胎盘组织TLR3、TLR4的mRNA、蛋白水平表达均显著低于其余两组；胎盘组织中TLR3、TLR4 mRNA表达与HBeAg水平呈负相关。此提示,HBeAg阳性CHB孕妇宫内感染HBV与TLR3、TLR4低表达关系密切,其对胎盘TLR3、TLR4表达可能起负调节作用。
　　 2.成功构建了1.3倍HBV全基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBV1.3,为研究HBV宫内感染的机制奠定了基础。通过诱导Bewo细胞产生IFN-β和TNF-α,TLR3、TLR4介导的天然免疫应答可抑制HBV复制,但随着HBV感染量的增大,其对HBV复制的抑制作用显著下降。TLR3介导抑制Bewo细胞中HBV复制主要呈TRIF依赖性,而TLR4主要依赖于调节蛋白MyD88。此提示,激活TLR3、TLR4可能成为一种新颖和有效防治HBV宫内感染的方法。
　　 3.成功构建了HBeAg真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBe,为研究内源性HaeAg对Bewo细胞TLRs表达的作用奠定了基础。polyI:C和LPS可显著诱导Bewo细胞TLR3、TLR4 mRNA表达,且可通过IFN-β自分泌反馈诱导TLR3表达。HBeAg通过下调细胞TLR3、TLR4 mRNA的表达,抑制NF-κB激活和细胞因子产生,从而干扰Bewo细胞的免疫功能。此提示,HBeAg下调胎盘滋养层细胞TLR3和TLR4表达效应可能是引起HBV宫内感染的一个重要的因为。
　　 主要创新点
　　 1.成功构建了1.3倍HBV全基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBV1.3,建立了新型的滋养层细胞HBV表达模型,为研究HBV宫内感染奠定了基础。
　　 2.成功构建了HBeAg真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBe,建立了滋养层细胞HBeAg表达模型,为研究胞内HBeAg对滋养层细胞TLRs表达及其生物效应的影响提供了一个良好的平台。
　　 3.HBeAg可下调胎盘滋养层细胞TLR3、TLR4表达及其生物效应,可能是胎盘持续感染HBV,并引起宫内感染的一种新的机理,对防治HBV宫内感染提供了新的理论和实验依据。

目录

文摘

英文文摘

前言

参考文献

第一部分 HBeAg阳性慢性乙型肝炎孕妇胎盘组织TLR3、TLR4的表达及意义

1.1 材料与方法

1.2 结果

1.3 讨论

参考文献

第二部分 TLR3、TLR4介导的天然免疫对Bewo细胞中HBV复制的作用

2.1 材料和方法

2.2 结果

2.3 讨论

参考文献

第三部分 HBeAg对Bewo细胞TLR3、TLR4表达及其生物效应的影响

3.1 材料和方法

3.2 结果

3.3 讨论

参考文献

全文小结

综述

参考文献

附录

缩略语

研究生期间主要科研成果

致谢

统计学审稿证明