一种人胎盘滋养层细胞系及其用途

摘要

本发明涉及一种人胎盘滋养层细胞系，于2005年9月22日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1461。该人胎盘滋养层细胞系是通过下述步骤建立的：从人正常妊娠6－7周的胎盘组织中分离到细胞滋养层细胞；从中筛选出具有增殖能力的细胞群；经过端粒酶催化亚基基因转染，获得了4个具有端粒酶活性的长寿命的细胞株。本发明建立的细胞系具备正常细胞的增殖特性和人类细胞滋养层细胞的生化功能，而且在裸鼠中不致瘤；同时细胞生长活跃，已经达到210世代，是一种永生化的人正常细胞滋养层细胞系，可用作筛选抗生育药物和治疗妊娠相关疾病药物的靶细胞模型，也为进一步研究人滋养层细胞功能提供了理想的体外模型，为研究胚胎植入和妊娠发生生理及病理机制的重要基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞系，具体地说是涉及一种人胎盘细胞滋养层细胞系，及其用途。

背景技术

妊娠过程中，胎盘是维系母体和胎儿之间营养和物质交换的重要内分泌器官，是胎儿发育和妊娠维持得以成功的重要保障。胎盘中最主要的组成细胞是滋养层细胞，包括单核的具有活跃增殖能力的细胞滋养层细胞(CTB)和多核的承担主要内分泌功能的合体滋养层细胞(STB)，STB是由CTB经过细胞膜融合而形成的。

从妊娠初始到结束，胎盘的大部分功能是由滋养层细胞来执行的。胚胎植入时，依靠滋养层细胞与子宫内膜的识别、粘附和侵润，种植并锚定到子宫内；同时滋养层细胞分泌多种激素、细胞因子等维持胚胎的正常发育和母胎间的营养和物质交换；妊娠结束时，滋养层细胞通过产生蛋白酶等促使胎盘从子宫上剥离。临床上，许多妊娠相关疾病都与滋养层细胞功能障碍有关，如自发流产、先兆子痫、葡萄胎、绒毛膜上皮癌等。因此，在胚胎植入和妊娠发生的生理及病理研究中，滋养层细胞功能调节的研究是关键的中心环节。

近一个世纪以来，很多学者致力于建立人胎盘滋养层细胞的体外培养体系，以获得能够模拟正常生理条件下滋养层细胞的功能调节的研究模型。最常用的是绒毛膜上皮癌细胞系，如Jar，JEG，BeWo，NUC-1，HCCM-5等在文献1：Ringler GE，Strauss JF III(1990)In vitro system for the study of human placental endocrine function.Endocr Rev 11，105-123中所述，它们虽然在某些内分泌功能上与正常滋养层细胞有一定的相似之处，但大部分功能调节尤其是增殖调节方面与正常细胞截然不同。Ho等在文献2：Ho CK，Chiang H，Li SY，Yuan CC，Ng HT(1987)Establishment and characterization of atumorigenic trophoblast-like cell line from a human placenta.Cancer Res 47，3220-3224.中报道了一种来自于正常足月胎盘的滋养层样细胞系-TL，但该细胞不能合成多种胎盘来源的激素，而且细胞形态和特性不均一，具有非整倍体染色体核型，在免疫功能缺陷的裸鼠中能够引发肿瘤产生，因而被认为是一群肿瘤化的非正常滋养层细胞系。1992年，Lei等在文献3：Lei KJ，Gluzman Y，Pan CJ，Chou JY(1992)Immortalization ofvirus-free human placental cells that express tissue-specific functions.Mol Endocrinol 6，703-712中，用温度敏感型的猴病毒SV40大T抗原基因转化人细胞滋养层细胞，获得几株细胞，它们在37℃的培养条件下，能够以肿瘤细胞的方式无节制增殖，在40℃培养条件下，增殖方式类似于正常细胞，但其激素分泌和调节方式却与正常滋养层细胞不尽相同，因此这些细胞仍然无法作为正常细胞滋养层细胞的代表。事实上，到目前为止，国际上还没有建立人正常滋养层细胞系，尽管众多的学者付出了极大的努力。这主要是由于将人作为研究对象，伦理问题导致获得人胎盘组织这一研究材料有一定的障碍(尤其在西方国家)，同时由于人的个体差异性很大，导致了来自于不同研究者的结果相互矛盾。

发明内容

本发明的目的在于提供一种永生化的、保持正常滋养层细胞功能的人胎盘滋养层细胞系，及其用途。

本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：

本发明提供的人胎盘滋养层细胞系，是通过下述步骤建立的：从人正常妊娠6-7周的胎盘组织中分离到细胞滋养层细胞；从中筛选出具有增殖能力的细胞群；经过端粒酶催化亚基基因转染，获得了4个具有端粒酶活性的长寿命的细胞株B6Tert-1、B6Tert-2、B6Tert-3和B6Tert-4。

本发明建立的B6Tert-1细胞，已于2005年9月22日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1461。

对B6Tert-1细胞进行生化和增殖特性的鉴定

细胞形态观察：倒置相差显微镜下观察，B6Tert-1细胞在培养皿中保持单层生长，为多角型的上皮样细胞，细胞为单核，每个细胞中含有1-5个核仁；在长期培养过程中很少观察到多核细胞；当细胞接种密度较低时，一些细胞可以伸拉得很长，用延伸的伪足样结构联系相距较远的细胞，如图1所示。这种均一的细胞形态一直保持到210世代，并能够继续延续。

本发明建立的B6Tert-1细胞具备正常细胞的增殖特性和人类细胞滋养层细胞的生化功能，而且在裸鼠中不致瘤；同时细胞生长活跃，已经达到210世代，是一种永生化的人正常细胞滋养层细胞系，可用作筛选抗生育药物和治疗妊娠相关疾病药物的靶细胞模型，也为进一步研究人滋养层细胞功能提供了理想的体外模型，为研究胚胎植入和妊娠发生生理及病理机制的重要基础。

附图说明

图1为在相差倒置显微镜下观察到的B6Tert-1细胞；其中，(A)为80世代的B6Tert-1细胞；(B)为接种密度较低时的B6Tert-1细胞，可伸出长的伪足样结构(*)；标尺为25μm。

图2为核酸印迹分析显示B6Tert-1细胞中hCGα和hCGβmRNA的表达，以胎盘绒毛(Placenta villi)来源的RNA作为阳性对照，管家基因GAPDH作为内参照。

图3为RT-PCR分析显示B6Tert-1细胞中多种MMPs和TIMPs mRNA的表达模式，以胎盘绒毛组织(Placenta vill)来源的RNA作为阳性对照，管家基因GAPDH作为PCR反应的内参照。

具体实施方式

实施例1.B6Tert-1细胞系的建立

首先从妊娠6-7周龄的人工流产胎盘(此时也可以称之为绒毛)中分离细胞滋养层细胞。从计划生育门诊获得无菌的绒毛组织3-5个，于冰浴中带回实验室；以下操作均在无菌操作台上进行。将组织置于预先冷却到4℃的PBS缓冲液中，洗去沾染的血块；将组织转移到新鲜的PBS缓冲液中，于解剖镜下分离绒毛和基底膜并弃去基底膜；收集绒毛并剪碎成2-3mm³的小块，转移到50ml离心管内，加入含有0.2-0.3％的胰蛋白酶(美国Sigma公司)的PBS缓冲液20ml，混匀后于4-9℃消化30-50min；离心(1000rpm，5min)后弃去上请液，加入20ml新鲜的FD培养液和终浓度为20-40IU/mL的DNA酶(美国GIBCO公司)，常温下消化5-15min；离心(1000rpm，5min)后弃去上请液，加入20-40ml新鲜的FD培养液悬浮组织，经150目尼龙网过滤，离心(1000rpm，5min)收集细胞；加入2mlFD培养液悬浮细胞，同时在10ml离心管中制备1.25％-2.5％的BSA密度梯度(下层为2ml配制于FD培养液的2.5％BSA溶液，上层为2ml配制于FD培养液的1.25％BSA溶液)，将细胞悬液小心加入BSA密度梯度上层，保持直立并在室温下沉降30-60min；收集最下层的细胞，用FD培养液悬浮后，按照2-4X10⁵/皿的密度接种于涂有6-10μg/cm² Cellmatrix(I型胶原，日本Osaka生物化学研究所)的35mm培养皿中，所用的条件培养液为添加了10ng/mL表皮生长因子(美国Sigma公司)、1μg/mL胰岛素(美国Sigma公司)、2mmol/L谷胺酰胺和0.1％BSA(美国Sigma公司)的FD培养液，1.5-2ml/皿，于37℃，5％CO₂条件的培养箱中培养。24h后，更换新鲜的条件培养液。

然后从培养的细胞中筛选能够保持增殖能力的细胞群。在上述培养条件下，连续培养细胞1-2个月，每24-48小时更换一次培养液。期间有大量的细胞漂浮起来并死亡，但有少量细胞保持贴壁生长，并开始缓慢增殖。待这些细胞增殖到铺满培养皿底面的70-90％时，进行消化传代，具体方法是：弃去培养液，用PBS缓冲液洗培养皿一次，加入1ml含0.05-0.1％胰蛋白酶的PBS液，将培养皿置于冰上5-10min，弃去胰蛋白酶液，加入100-200μl PBS液，将培养皿置于37℃培养箱内5-10min，取出并加入适量条件培养液悬浮细胞，接种于另外2-3个新的涂有Cellmatrix的35mm培养皿内，继续按照上述方法培养。

随后向细胞中导入端粒酶催化亚基基因(htert)。培养上述增殖细胞至第10-20代，待细胞铺满培养皿底面的40-60％时，进行基因转染。具体方法是：

1)准备至少2皿细胞；

2)在一个小管中，将6μl FuGene6(德国Boehringer Mannheim公司)试剂与94μlFD培养液均匀混和，于室温下放置5min；

3)另取两个小管，一个加入溶解在5-20μl水中的10-40μg htert表达质粒pGRN145(美国Geron公司)，另一个加入等体积的水；

4)将2)中稀释的FuGene6试剂分别逐滴加入3)中的两个小管中，同时轻柔摇动小管以混匀；室温放置15min；

5)将4)中混匀的试剂分别加入1)中准备好的两个培养皿中，注意保证在培养皿各个部位均匀滴加；其中加入FuGene 6试剂和htert表达质粒pGRN145混合物的细胞为实验组，另一个加入FuGene 6试剂和水混合物的细胞为阴性对照组；

6)将细胞放入培养箱中培养5-10小时；

7)更换新鲜的条件培养液继续培养24小时；

8)加入3-10μg/ml Hygromycin(美国SIGMA公司)，连续培养5-10天，并通过更换培养液弃去死亡的细胞。

之后进行细胞的克隆和扩增工作。细胞经过上述基因转染和药物筛选处理后，对照组的细胞几乎全部死亡，而实验组有1-5％的细胞存活，并且呈现小克隆生长。借助显微镜观察，标记出这些小克隆，弃去培养液后，将底部涂有薄层凡士林油的克隆环盖在标记的克隆上面，按照前面所述的方法将各个克隆环内的细胞消化下来，分别接种于涂有Cellmatrix的24孔培养板内，加入1ml条件培养液进行常规培养。待细胞生长到铺满70-90％培养板底面后，再次消化并接种于涂有Cellmatrix的35mm培养皿内，细胞铺满培养皿后，按照1∶3的比例进行消化传代，使细胞逐渐得以扩增。

在长期培养过程中，为了能够保存细胞，需要对细胞进行冷冻。细胞消化后，移入10ml离心管中，并添加5-10ml FD培养液，离心(1000rpm，5min)并弃去上清液，用1ml预先冷却至4℃的细胞冷冻液(FD培养液中添加10％胎牛血清和10％二甲基亚砜)悬浮细胞，移入细胞冻存管中，依次置于4℃ 30min，-20℃ 60min和-80℃过夜后，转入液氮中保存。

经过上述过程，共获得4个稳定的克隆细胞株，分别被命名为B6Tert-1、B6Tert-2、B6Tert-3和B6Tert-4。经过近3年的培养，目前B6Tert-1细胞已经达到210世代(细胞分裂一次即为一个世代)，没有出现任何衰老特征。细胞生物学界普遍接受的观点是细胞寿命超过100世代即为达到了永生化，因此我们所建立的B6Tert-1细胞已经是永生化的细胞。该B6Tert-1细胞已于2005年9月22日保藏于保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1461。

实施例2.细胞增殖特性分析

1)细胞的增殖速度

B6Tert-1(80PDs)细胞按照10⁴个/皿接种于涂有Cellmatrix的35mm培养皿中，从第1-11天每天均随机取三皿进行细胞计数，并由此绘制细胞增殖曲线。结果显示，B6Tert-1的细胞倍增时间为36小时；细胞于第9天达到汇合状态(即细胞紧密接触，培养皿内没有多余的空隙)，此时细胞增殖速度减慢并最终停止增殖。这种现象被成为细胞生长的“接触抑制”，是正常细胞的增殖特性之一。

2)表皮生长因子(EGF)和转化生长因子(TGF)β对细胞增殖的调节：

将B6Tert-1细胞按照5×10⁵个/皿接种于涂有Cellmatrix的35mm培养皿中，用1-100ng/ml EGF刺激细胞48小时后，各个刺激剂量分别选取三皿细胞，进行细胞计数。结果显示，B6Tert-1细胞增殖受EGF调节，1-100ng/ml EGF能够刺激B6Tert-1细胞增殖，随着EGF浓度的增加，细胞增殖速度也加快，EGF对细胞增殖的最大刺激效应为100ng/ml。

将B6Tert-1细胞按照5×10⁵个/皿接种于涂有Cellmatrix的35mm培养皿中，加入10ng/ml EGF，同时加入0，0.1，1和10ng/ml TGFβ，处理48小时后，每一刺激剂量分别选取三皿细胞，进行细胞计数。结果显示，在B6Tert-1细胞中，TGFβ本身并不影响细胞增殖，但能够部分地拮抗EGF的作用；10ng/ml TGFβ作用48小时使两种细胞中EGF引起的细胞增殖量均减少了约35％。

可见，B6Tert-1细胞的增殖分别受到不同生长因子的正向和副向调节作用，具有较强的可调节性。

实施例3.细胞致瘤性分析(Tumorigenicity)

将生长至80世代和210世代的B6Tert-1细胞按照10⁷细胞/100μl分别皮下注射至裸鼠中，每个世代的细胞注射3只裸鼠。观察裸鼠中的肿瘤生长状况。三个月后，未见裸鼠中有任何肿瘤形成。可见，B6Tert-1细胞不具备致瘤性。

实施例4.染色体分析

对80世代和210世代的B6Tert-1细胞进行染色体分析，通过分析各自约100个分裂中期的细胞染色体，发现它们都有正常人体细胞的双倍体核型，含有46条染色体，其中包括性染色体X和Y。可见，B6Tert-1细胞的染色体为正常细胞核型。

实施例5.滋养层细胞特性分析

选用80-100世代的B6Tert-1细胞进行生化特性分析，结果分别叙述如下：

1)细胞角蛋白(Cytokeratin，CK)的表达

细胞角蛋白是上皮来源的细胞中特异的细胞骨架蛋白，可以分为多种亚型。人胎盘滋养层细胞是上皮来源的细胞，具有CK7，Ck8，CK18等多种细胞角蛋白。

实验采用免疫细胞化学方法鉴定B6Tert-1细胞中CK8蛋白的分布。将培养的B6Tert-1细胞用0.125％的戊二醛(含3％蔗糖)于37℃固定20分钟，然后孵育于0.3％的H₂O₂中以去除内源性的过氧化物酶。滴加鼠抗人CK8抗体(1∶100；SIGMA)后于4℃孵育过夜。第二天，用PBS洗细胞3遍后，加入辣根过氧化物酶标记的Polymer(DAKOEnvision^TM试剂盒提供)室温孵育30min，PBS洗3遍。加入二氨基联苯胺显色5-15min，自来水冲洗以终止显色反应。在显微镜下进行阳性信号的观察。结果发现超过99％的B6Tert-1细胞都呈现CK8的免疫阳性染色，表明它们都是上皮细胞来源，符合正常滋养层细胞的特性。

2)人绒毛膜促性腺激素(hCG)的表达

人绒毛膜促性腺激素hCG是人胎盘滋养层细胞特异产生的激素，该蛋白主要由两个亚基组成，即hCGα和hCGβ。正常情况下，细胞滋养层细胞只能够合成hCGα，不具备激素功能，只有合体滋养层细胞才能够合成两种亚基，组成功能性的hCG蛋白。因此，hCGα的表达可以作为细胞滋养层细胞的标志，而hCGβ的表达是细胞滋养层细胞发生合体化的标志之一。检测这些分子表达的手段是核酸印迹分析。其具体的操作如下：

i.细胞内或组织内总RNA的提取

按TRIzol试剂(Invitrogen，美国)说明提取细胞和组织中的总RNA：按10⁶细胞/ml TRIzol试剂的比例向细胞中加入TRIzol试剂；对于组织，则按照100mg组织/mlTRIzol试剂的比例加入TRIzol试剂，置于冰上，进行匀浆，将匀浆后的液体收集到离心管中；上述样本于室温放置5min后加入200μl氯仿，用力振荡25秒，室温放置3min；4℃离心13,000rpm/15min使液体分层；将上层含RNA的水相吸至新离心管中，加入0.5ml异丙醇，轻轻晃匀，室温放置10min使RNA沉淀；4℃离心13,000rpm/10min，使RNA在离心管底积压成小块；倾去异丙醇，以70％乙醇洗涤RNA沉淀，4℃离心10,000rpm/5min收集RNA；室温干燥，加入无菌水溶解RNA。

ii. RNA凝胶电泳和转移

将1.6g琼脂糖混入100ml去离子水中，加热溶解，待冷却至60℃左右后，加入32ml 5×MOPS缓冲液和29.2ml甲醛，混匀倒入凝胶托板中，室温下凝固1小时，制成1％的电泳凝胶。将25μg总RNA样品(9μl)、4μl 5×MOPS、7μl甲醛、20μl去离子甲酰胺和4μl 10×加样缓冲液(50％甘油，1mM EDTA(pH8.0)，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯氰)混合，65℃加热变性10min，迅速置于冰上冷却5min。将样品加入凝胶的点样孔，按照4V/cm恒压电泳，待溴酚蓝迁移至凝胶底部时停止电泳(约2-3h)。室温下用去离子水漂洗凝胶，10min×2遍；以20×SSC缓冲液漂洗凝胶，室温，15min×2遍。剪取适当大小的Hybond⁺尼龙膜(美国Pharmacia公司)，在20×SSC中浸泡5min；将胶叠加在膜上，置于真空转运仪(Pharmacia)，50mBar转移1-3h。转移后的尼龙膜在2×SSC漂洗一下，在紫外交联仪中交联10sec，使RNA与膜共价结合。尼龙膜可置于4℃保存。

iii.探针标记和纯化

根据Genebank中hCGα、hCGβ基因和管家基因GAPDH的cDNA序列，分别设计引物序列如下，并由上海深能博采公司合成：

hCGα：上游引物5’-CGAAGGGTTAGTGTCGAGC-3’

下游引物5’-ATGGACTTGGAAGGCTGG-3’

hCGβ：上游引物5’-TTCCTACACCCTACTCCCTGT-3’

下游引物5’-CCGGCAGGACCCCCTGCAGCA-3’

GAPDH：上游引物5’-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3’

下游引物5’-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3’

于冰上混匀下列反应体系(总体积20μl)，进行逆转录反应：

人胎盘组织总RNA(1μg/μl)                  2μl

寡聚脱氧鸟苷酸(500μg/ml，Promega公司)     1μl

脱氧核糖核酸(10mmol/L，Invitrogen)         1μl

无菌去离子水(Invitrogen)                   12μl

65℃加热变性5min后，迅速置于冰上2min；再加入4μl 5×逆转录缓冲液(Invitrogen)，混匀，42℃孵育2min；再加入1μl Superscript II逆转录酶(Invitrogen)，混匀，42℃孵育50min。70℃加热15min灭活反应后，将反应产物(即cDNA模板)保存在-20℃。

随后于冰上混匀如下PCR反应体系(总体积50μl)：

10×PCR缓冲液(Promega)                     5μl

MgCl₂(25mmol/L，Promega)                   2μl

dNTP(各10mmol/L)                           1μl

上游引物(10μmol/L)                        1μl

下游引物(10μmol/L)                        1μl

去离子水                                   37μl

逆转录反应获得的cDNA模板                   1μl

Taq DNA Polymerase  (Promega)       2μl

混匀后，在PCR仪上进行如下扩增程序：94℃/3min→[94℃/30 sec→56-67℃(因不同的扩增基因而不同)/30sec→72℃/50sec]×30个循环→72℃/5min。

PCR产物送交上海深能博采公司进行测序，序列符合hCGα和hCGβ基因cDNA片段的可作为核酸印迹杂交的探针。

采用prime-a-gene试剂盒(Promega)按照随机引物法进行探针的[α-³²P]放射性标记。混和如下成分：

5×标记缓冲液(Promega)                     10μl

无dCTP的dNTP混合物(Promega)                2μl

加热至98℃变性的PCR产物                    25ng

无核酸酶的BSA(Promega)                     2μl

[α-³²P]dCTP(3000Ci/mmol，北京亚辉公司)    5μl

DNA聚合酶Klenow片段(Promega)               5U

加无核酸酶的水到终体积                     50μl

混匀，室温反应1h，即可获得[α-³²P]标记的cDNA探针。

iv.杂交

尼龙膜贴壁置于杂交玻璃管内，加入10ml预杂交液，65℃孵育4h；弃去预杂交液，加入5ml新鲜杂交液(预杂交液中加入10％硫酸葡聚糖)和变性探针(标记好的探针于95-100℃水浴中加热10min，迅速置于冰上)，混匀，65℃杂交过夜(15-20 h)。将杂交液倒在安全废液缸中，用洗膜液I(1×SSC，0.1％SDS)室温洗涤杂交膜30min，用洗膜液II(25mM的NaH₂PO₄.2H₂O，25mM的Na₂HPO₄.12H₂O，1mM的EDTA，1％SDS)于65℃洗膜30min×3次。杂交后的尼龙膜封于保鲜膜中，在暗室叠放于X光片(日本富士)上，置于压片盒中，-80℃曝光1～7天。

v.洗片

在暗室将X光片在显影液中显影，安全灯光(显影红灯)下观察显影程度，及时中止显影，然后置于定影液中定影5min，自来水冲净，晾干。

通过上述的核酸印迹杂交过程，发现B6Tert-1细胞中有一定水平的hCGα表达，而未检测到hCGβ表达，如图2所示。表明B6Tert-1细胞是细胞滋养层细胞，没有发生合体化。

3)促性腺激素释放激素(GnRH)的分布

正常细胞滋养层细胞能够产生一定量的GnRH。首先按照常规方法制备兔抗人GnRH多克隆抗体。将GnRH十肽与BSA耦联，与付氏完全佐剂充分混匀后，按照150μg/只兔的蛋白量皮下多点注射新西兰兔，每间隔两周加强注射一次，共加强注射4次，从第三次免疫后一周开始测定血清抗体滴度，末次免疫两周后处死兔，并心脏采血，分离血清冻存于-20℃。

通过类似于细胞角蛋白检测的免疫细胞化学分析方法，分析GnRH在细胞中的分布情况，结果表明超过98％的B6Tert-1细胞呈现GnRH免疫阳性反应，信号主要定位于细胞质中。这进一步说明B6Tert-1细胞具备细胞滋养层细胞的特性。

4)基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)及其组织抑制因子(tissueinhibitor of MMPs，TIMPs)的表达

MMPs和TIMPs是细胞滋养层细胞产生的蛋白酶和抑制剂，它们的产生使滋养层细胞具备一定的侵润能力。本研究应用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)检测B6Tert-1细胞产生MMPs和TIMPs的能力。

根据目的基因的GenBank登录号，检索其cDNA序列。利用Omiga软件进行引物设计(见下表1)，由上海申能博彩公司合成。

表1  用于PCR反应的引物序列和反应条件

  基因名称  引物序列(F：上游引物；R：下游引物) 退火温度(℃) 循环数  MMP-2  F：5’-ACCTGGATGCCGTCGTGGAC-3’  R：5’-TGTGGCAGCACCAGGGCAGC-3’     56   30  MMP-9  F：5’-GTGCTGGGCTGCTGCTTTGCT-3’  R：5’-GTCGCCCTCAAAGGTTTGGAA-3’     67   30  MMP-14  F：5’-ATTGAATTCAGCCCCGAAGCCTGGC-3’  R：5’-ATTGAATTCTCAGGCCCTCACGGA-3’     57   28  TIMP-1  F：5’-GCGTTATGAGATCAAGATGACC-3’  R：5’-AGGCTTCAGCTTCCACTCC-3’     58   28  TIMP-2  F：5’-ATCACCCTCTGTGACTTCATCG-3’  R：5’-ATTCATGCTGTTTCCAGGAAGG-3’     58   28  TIMP-3  F：5’-TGCCAGAAAGAATGAGGAACC-3’  R：5’-AGAGAGGGTGCTGACGGTGTT-3’     56   30

随后进行逆转录反应和PCR反应，具体方法如上所述。

PCR反应结束后，将0.2g琼脂糖加入20ml TE缓冲液中，加热溶解后，倒入凝胶托板中，制成1％琼脂糖凝胶；将10μl PCR反应产物加入凝胶的加样孔中，按照4V/cm恒压电泳，待溴酚蓝迁移至凝胶底部时停止电泳(约1-2h)。在紫外灯下检测PCR产物的电泳结果，并用凝胶紫外扫描分析仪成像(美国UnitedBio公司)，如图3所示，RT-PCR分析显示B6Tert-1细胞中多种MMPs和TIMPs mRNA的表达模式，胎盘绒毛组织(Placenta vill)来源的RNA作为阳性对照，管家基因GAPDH作为PCR反应的内参照。

通过上述的RT-PCR反应，证实B6Tert-1细胞中有MMP-2、-9、-14及TIMP-1、-2、-3，-4mRNA的表达，具备一定的侵润能力。

上述细胞增殖和生化特性的鉴定，表明B6Tert-1细胞具备正常细胞的增殖特性和人类细胞滋养层细胞的生化功能，而且在裸鼠中不致瘤；同时细胞生长活跃，已经达到210世代。因此，B6Tert-1细胞是永生化的人正常细胞滋养层细胞系。

本发明中提到的几种溶液的配方如下：

1.FD培养液：将下列药品溶解后，经过0.22μm滤膜过滤并无菌保存于4℃。

F12(GIBCO公司)    10.6g

DMEM(GIBCO)       13.4g

青霉素            20万单位

链霉素            20万单位

HEPES             1.686g

NaHCO₃           2.4g

去离子水          2000ml

2.PBS缓冲液：将下列药品溶解后，经过0.22μm滤膜过滤并无菌保存于4℃。

NaCl              8g

KCl               0.3g

Na2HPO4           1.83g

KH2PO4            0.02g

葡萄糖            2g

去离子水          1000ml

3.5XMOPs缓冲液：

乙酸钠        2.72g

MOPs          10.3g

0.5M EDTA     5ml

将上述药品混和于493ml去离子水中，加入2ml 10NNaOH混匀后，经过0.22μm滤膜过滤并避光保存于常温。

4.20XSSC缓冲液：将下列药品溶解于1000ml去离子水中，并用1N NaOH调节PH值为7.0。常温保存。

NaCl            175.3g

柠檬酸三钠      88.2g

5.预杂交液：将下列试剂溶解于去离子水中，并定容至100ml。保存于4℃。

SDS(十二烷基磺酸钠)       7g

Na2HPO4-12H2O             4.9g

NaH2PO4                   0.988g

0.5M EDTA                 0.2ml

BSA                       1g

甲酰胺                    15ml

6.TE缓冲液：

0.5M Tris缓冲液(pH8.0)    2ml

0.5M EDTA                 0.2ml

去离子水                  98ml

7.0.5M Tris缓冲液(pH8.0)

在800ml去离子水中溶解60.55g Tris，加入约21ml浓盐酸调节pH至8.0，用去离子水定容至1000ml。