H2S通过抑制p38 MAPK/坏死性凋亡通路保护人脐静脉内皮细胞对抗高血糖引起的损伤及炎症

摘要

研究背景:
　　2016年世界卫生组织发布的全球糖尿病报告指出中国的成年人糖尿病患病率接近10％，而糖尿病血管病变是糖尿病最常见的并发症，其高致残率与致死率给国家和患者带来了巨大的经济负担。因此，探索糖尿病血管病变的发病机制，制定正确的治疗策略和寻求有效的治疗药物，成为目前防治糖尿病心血管并发症亟需解决的问题。
　　研究目的:
　　(1)探讨p38MAPK/坏死性凋亡通路在高糖（high glucose，HG）诱导的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)损伤及炎症中的作用;(2)探讨硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)是否通过调控p38MAPK/坏死性凋亡通路保护HUVECs对抗HG诱导的损伤及炎症。
　　研究方法:
　　1.细胞计数检测试剂盒-8（CCK-8）检测HUVECs存活率;
　　2.Western blot法检测HUVECs中受体相互作用蛋白3（RIP3，为坏死性凋亡的指标）、cleaved caspase-3、caspase-9、p38MAPK的表达水平;
　　3.免疫荧光法检测p38MAPK的表达水平;
　　4.双氯荧光素(DCFH-DA)染色法检测细胞内活性氧(ROS)水平;
　　5.罗丹明123(Rh123)染色法检测细胞线粒体膜电位(MMP);
　　6.Hoechst33258核染色法荧光显微镜照相检测细胞凋亡数量;
　　7.酶联免疫吸附实验(ELISA)检测相关炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)分泌水平;
　　8.小干扰RNA转染细胞，敲除RIP3;
　　9.实验数据以均数±标准误(mean±SEM)来表示，使用SPSS20.0统计学软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学显著性。
　　研究结果:
　　一、p38MAPK/坏死性凋亡通路介导高血糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤及炎症
　　1.高浓度葡萄糖（40mmol/l，HG）上调HUVECs的p-p38MAPK表达;
　　2.HG上调HUVECs的RIP3表达;
　　3.葡萄糖浓度依赖性降低细胞存活率;
　　4.坏死性凋亡抑制剂(Nec-1)、RIP3-siRNA及p38MAPK抑制剂减轻HG引起的HUVECs的细胞毒性;
　　5.坏死性凋亡抑制剂、RIP3-siRNA及p38MAPK抑制剂对抗HG诱导的HUVECs内ROS产生;
　　6.坏死性凋亡抑制剂、RIP3-siRNA及p38MAPK抑制剂对抗HG诱导的HUVECs的MMP丢失;
　　7.坏死性凋亡抑制剂、RIP3-siRNA及p38MAPK抑制剂对抗HG诱导的HUVECs的炎症反应，使IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α分泌水平降低;;
　　8.坏死性凋亡及细胞凋亡存在负反馈调节作用;
　　8.1HG上调HUVECs的cleaved caspased-3表达;
　　8.2坏死性凋亡抑制剂Nec-1促进cleaved caspase-3及caspase-9蛋白表达;
　　8.3凋亡抑制剂Z-VAD促进RIP3蛋白表达;
　　9.p38MAPK通路与坏死性凋亡通路存在正反馈调节。
　　二、H2S通过抑制p38MAPK/坏死性凋亡通路保护HUVECs对抗HG诱导的损伤及炎症
　　1.H2S抑制HG对HUVECs的p-p38MAPK表达的上调作用;
　　2.H2S抑制HG对HUVECs的RIP3表达的上调作用;
　　3.H2S通过抑制p38MAPK/坏死性凋亡通路减轻HG引起的HUVECs的细胞毒性，使细胞存活率增加;
　　4.H2S减轻HG诱导的HUVECs凋亡;
　　5.H2S通过抑制p38MAPK/坏死性凋亡通路减少HG诱导的HUVECs内ROS产生;
　　6.H2S通过抑制p38MAPK/坏死性凋亡通路减轻HG对HUVECs线粒体损伤作用;
　　7.H2S通过抑制p38MAPK/坏死性凋亡通路减少HG诱导的上述的HUVECs炎症因子的分泌。
　　研究结论:
　　1.p38MAPK/坏死性凋亡通路介导HG引起的HUVECs损伤和炎症;
　　2.H2S通过抑制p38MAPK/坏死性凋亡通路保护HUVECs对抗HG诱导的损伤及炎症。

目录

摘要

前言

第一章 p38 MAPK／坏死性凋亡通路介导HG诱导的HUVECs引起的损伤及炎症

前言

材料与方法

结果

讨论

第二章 H2S通过抑制p38 MAPK／坏死性凋亡通路保护HUVECs对抗HG诱导的损伤及炎症

前言

材料与方法

结果

讨论

总结

参考文献

附录

攻读学位期间成果

致谢

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