1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶类广谱RAF激酶抑制剂的抗肿瘤作用及其作用的分子机理研究

摘要

由RAF激酶介导的RAS/RAF/MEK/ERK通路在肿瘤的发生、发展与转移中发挥着重要的作用，到目前为止得到广泛的研究。该通路中的关键性激酶RAF，可以通过依赖或者不依赖RAS激酶的方式来产生信号传导作用。鉴于此，RAF激酶抑制剂已成为当前抗肿瘤药物研究的热点。
　　本文以1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶环为铰链结合区模板设计、合成系列新的化合物，评价化合物的激酶抑制活性、体外抗细胞增殖活性，研究体外抗肿瘤作用分子机理，为发现活性更高，结构更新颖的的广谱RAF激酶抑制剂提供实验依据。
　　主要研究工作和结果:
　　1.鉴于1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶核的结构与嘌呤的结构类似，可以通过氢键与铰链区的ATP结合口袋结合，可作为激酶铰链结合区模板。为了发现有效的RAF激酶抑制剂，以Sorafenib为先导化合物，用1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶环代替吡啶环设计出化合物1a，分子对接显示1a能与激酶的活性口袋进行很好的结合。以4，6-二氯-5-嘧啶甲醛为原料，经成环、1-NH四氢吡喃保护、4-苯氧基取代、与芳基异氰酸酯缩合反应、脱保护等反应合成1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶衍生物(1a-1t)，以4，6-二氯-5-嘧啶甲醛为原料，经成环、1-NH甲基化、4-苯氧基取代、芳基异氰酸酯缩合反应等反应合成1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶衍生物（1u-1v），共22个目标化合物。
　　2.对上述合成的目标化合物进行了BRAFV600E激酶活性测试，有12个化合物在1μM浓度下对BRAFV600E的抑制率大于60％，其中1v对BRAFV600E的抑制活性优于Sorafenib，其IC50值为23.6nM。细胞抗增殖实验显示大部分化合物对肿瘤细胞（A375、HT-29、PC-3、A549）表现出较强的抗增殖活性，且对正常细胞(MDCK)毒性较小。
　　3.激酶选择性实验表明，1v不仅对BRAFV600E有很好的抑制活性，还对BRAF(wt)(IC50=51.5nM)和CRAF(IC50=8.5nM)表现出较强的抑制活性。此外，对其它13种激酶几乎无抑制活性（抑制率＜30％），结果显示1v是具有选择性的pan-RAF激酶抑制剂。
　　4.细胞划痕实验表明，1v能抑制A375细胞的迁移能力，且呈浓度依赖性。细胞周期分析结果显示，1v可诱导A375细胞阻滞在G0/G1期，并将PC-3细胞阻滞在G2/M期。
　　5.Western blot结果表明，1v能抑制RAF下游信号分子MEK的激活，下调了A375、HT-29细胞中MEK磷酸化蛋白的表达，并呈现出剂量依赖性。且能抑制A375细胞中周期调控蛋白cyclinD1的表达。
　　6.对1v与BRAF复合物体系进行了分子动力学模拟和结合自由能分析。化合物1v与BRAFV600E的结合自由能为负值，说明化合物1v与BRAFV600E存在较强的作用，能量项的分解表明范德华力、静电作用和非极性溶剂化对1v与BRAFV600E的结合是有利的，而极性溶剂化能是不利于结合的。

目录

摘要

1．1 研究背景

1．2 RAF激酶抑制剂的研究概况

1．2．1 RAF激酶抑制剂的结合模式

1．2．2 RAF激酶抑制剂的分类

1．3 研究思路

第二章 RAF激酶抑制剂的设计、合成

2．2 1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶类化合物的合成路线

2．3 实验部分

2．3．1 试剂与仪器

2．3．2 1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶类化合物的合成

2．3．3 1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶化合物的合成

第三章 1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶类化合物对蛋白激酶活性和细胞增殖活性的影响

3．1 实验部分

3．1．1 材料、试剂与仪器

3．1．2 BRAFV600E激酶在Z’-LYTE?激酶活性检测反应体系中最适浓度的优化

3．1．4 所选目标化合物对BRAFV600E激酶IC50值的测定

3．1．5 目标化合物对细胞增殖活性的测定

3．2 实验结果与分析

3．2．1 1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶类化合物对BRAFV600E激酶活性的评价

3．2．2 1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶类化合物对细胞增殖活性的评价

第四章 化合物1v对RAF蛋白激酶活性的影响

4．1 实验部分

4．1．1 试剂与仪器

4．1．2 实验方法

4．2 实验结果与分析

4．2．2 化合物1v对RAF蛋白激酶的抑制活性

第五章 化合物1v对肿瘤细胞迁移和细胞周期分布的影响

5．1 实验部分

5．1．1 主要实验材料

5．1．2 主要仪器

5．1．3 实验方法

5．2 实验结果与分析

5．2．1 化合物1v对A375细胞迁移的影响

5．2．2 化合物1v对肿瘤细胞周期分布的影响

第六章 化合物1v抗肿瘤作用的分子机制

6．1 实验部分

6．1．1 细胞系

6．1．2 细胞培养材料

6．1．3 主要生化试剂

6．1．4 抗体

6．1．5 实验方法

6．2 实验结果与分析

6．2．1 Western blot检测1v作用A375、HT-29细胞后MEK磷酸化蛋白表达变化

6．2．2 Western blot检测1v对A375细胞周期蛋cyclinD1表达的影响

第七章 化合物1v与BRAF复合物的分子动力学模拟

7．1 实验部分

7．1．1 实验材料和仪器

7．1．2 分子对接

7．1．3 分子动力学模拟

7．2 实验结果与分析

7．2．1 分子动力学模拟的稳定性

7．2．2 氢键分析

7．2．3 MM-PBSA和MM-GBSA结合自由能计算

讨论

结论

参考文献

缩写词列表

附图

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢

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