开菲尔中菌种资源的分离培养与部分功能菌株研究

摘要

开菲尔酸奶是一种历史悠久的发酵乳制品，由乳酸菌、醋酸菌、酵母菌等多种益生菌组成。开菲尔酸奶含有丰富的活性物质，具有多种益生功能。乳酸菌产生的细菌素可以杀死食品中的腐败微生物，它天然健康，无毒、无害，因此在对新型食品防腐剂的研发领域具有很大的潜力。除此之外有些乳酸菌菌株具有降胆固醇的功能，因此对开菲尔菌种的初步分析相当于建立了一个益生菌的资源库，为后续益生功能的研究奠定了基础。基于以上背景，本论文的研究内容主要包括开菲尔菌种的筛选和鉴定，开菲尔菌种宏基因组的测序分析，开菲尔中乳酸菌产细菌素菌株的初步筛选，开菲尔中乳酸菌降胆固醇菌株的初步筛选。（1）开菲尔菌种的筛选及细菌16SrDNA和酵母菌26SrDNA的鉴定：分别用MRS、AC、YEPD培养基分离，随后采用细菌16SrDNA和酵母菌26SrDNA的PCR扩增技术，并对扩增产物进行序列比对。结果得到6种乳酸菌，分别是：肠膜明串球菌（Leuconostoc mesenteroides），肠膜明串球菌亚种（Leuconostoc mesenteroidessubsp.mesenteroides），乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），乳酸乳球菌亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis），植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），植物乳杆菌亚种（Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum），共47株；3种醋酸菌，分别是东方醋酸菌（Acetobacter orientalis），冲绳醋酸菌（Acetobacter okinawensis），株醋酸菌（Acetobacter ghanensis），共19株；1种酵母菌为（Kazachstania unispora）哈萨克斯坦酵母，共7株；除此之外还有1株嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和4株粪肠球菌（Enterococcus faecalis）。
　　（2）开菲尔菌种宏基因组的测序分析：开菲尔组成复杂，乳酸菌是其优势菌种，并且不同来源的开菲尔菌群具有高度相似性。从门水平观察，开菲尔菌群主要由硬壁菌门和变形菌门组成，从属的水平观察主要由乳酸菌属和醋酸杆菌属组成，其次是链球菌属和芽孢杆菌属,而丙酸杆菌属、红螺菌科、新鞘氨醇杆菌所占比例极小。
　　（3）开菲尔中乳酸菌产细菌素菌株的初步筛选：实验采用牛津杯法对从开菲尔酸奶中分离鉴定出的乳酸菌菌株进行抑菌圈实验，筛选2次，结果表明这些乳酸菌菌株对酵母菌没有抑菌活性，对四种细菌指示菌均有抑菌效果，其中四株乳酸乳球菌亚种（Lactococcus lactissubsp.lactis）产生的抑菌圈直径较为明显。
　　（4）开菲尔中乳酸菌降胆固醇菌株的初步筛选：对开菲尔酸奶中分离鉴定出的乳酸菌菌株进行筛选，筛选2次，结果表明有17株菌的降胆固醇能力较好，其中一株为肠膜明串球菌亚种（Lc mesenteulides subsp. mesenteulides）；另一株为乳酸乳球菌亚种（Lactococcus lactissubsp.lactis）。

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英文缩略词表

目录

1前言

1.1 课题的研究背景

1.1.1 开菲尔益生功能的开发

1.1.2 食品防腐剂的安全问题

1.1.3 胆固醇乳酸菌筛选的背景

1.1.4 将宏基因组技术应用于开菲尔

1.2 开菲尔酸奶及其益生功能研究的概述

1.2.1 开菲尔粒的历史发源

1.2.2 开菲尔粒的微生态特点

1.2.3 开菲尔的益生功能

1.3 开菲尔益生菌的应用前景

1.4 主要研究内容及意义

1.4.1 研究目的与意义

1.4.2 主要研究内容

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 开菲尔菌种来源

2.1.2 细菌素抑菌圈指示菌

2.1.3 实验仪器设备

2.1.4 常用药品与试剂

2.1.5 培养基

2.1.6 常用试剂配制

2.2 实验方法

2.2.1 开菲尔菌群的分离纯化

2.2.2 细菌16SrDNA和酵母菌26SrDNA分子生物学鉴定

2.2.3 开菲尔菌群宏基因组测序分析

2.2.4 开菲尔乳酸菌中产细菌素菌株的筛选

2.2.5 开菲尔乳酸菌中降胆固醇菌株的筛选

3 结果与分析

3.1 宏基因组测序分析

3.1.1 四种来源的开菲尔粒中菌群的组成比较

3.2 分离自开菲尔菌株的16SrDNA生物学鉴定结果

3.2.1 乳酸菌16SrDNA生物学鉴定结果

3.2.2 醋酸菌16SrDNA生物学鉴定结果

3.2.3 酵母菌26SrDNA生物学鉴定结果

3.2.4 进化树的构建

3.3 开菲尔乳酸菌产细菌素菌株的筛选结果

3.3.1 开菲尔乳酸菌产细菌素菌株的初筛结果

3.3.2 开菲尔乳酸菌产细菌素菌株的复筛结果

3.4 开菲尔乳酸菌降胆固醇菌株的筛选结果

3.4.1 邻苯二甲醛法制作标准曲线

3.4.2 开菲尔乳酸菌中降胆固醇菌株的初筛结果

3.4.3 开菲尔乳酸菌中降胆固醇菌株的复筛结果

4 讨论与结论

4.1 讨论

4.1.1 开菲尔中菌种的分离鉴定及其宏基因组分析

4.1.2 开菲尔乳酸菌中产细菌素菌株的筛选

4.1.3 开菲尔乳酸菌中降胆固醇菌株的筛选

4.2 结论

4.3 创新之处

4.4 展望

致谢

参考文献

附 录A

附 录B