食品加工环境中单核增生李斯特菌生物被膜菌群结构分析

摘要

单核增生李斯特菌作为常见的食源性致病菌，致死率高达20-40％，被世界卫生组织定义为四大食源性病原菌之一。在全球环境卫生和食品安全备受关注的背景下，消毒剂在医疗卫生、畜牧兽医、食品、日化加工生产环境中的使用日益增加。随着消毒剂选择压力的增大，病原微生物对其抵抗力也不断在增加。生物被膜的形成是微生物对消毒剂产生抗性的重要原因之一，而自然界中的生物被膜往往都是以多种微生物共同存在的形式出现的，单核增生李斯特菌也不例外。生物被膜中单核增生李斯特菌和共栖菌形成生物被膜，有助于细菌在消毒剂胁迫环境中存活下来。
　　在这项研究中，我们调查了食品加工设备中的单核增生李斯特菌阳性生物被膜样本，并鉴定出生物被膜样品中的优势共栖菌，以了解该微生物菌群的生态背景特征。主要的研究内容和结果如下:
　　1.我们利用ISO11290标准来检测和鉴定单核增生李斯特菌，并用16S rDNA和hly基因进一步鉴别。结果显示，100个来自4个不同的食品厂下水道环境样品中，共有8个地漏样品分离出单核增生李斯特菌。
　　2.研究了8株单核增生李斯特菌对消毒剂的耐受性，其对苯扎溴铵的药物敏感性MIC值为18～35μg/ml，可见消毒剂环境下食品加工设备中的单核增生李斯特菌对苯扎溴铵存在耐药性。
　　3.采用16S rDNA基因克隆文库法、T-RFLP和DGGE这三种分子技术相结合对食品加工环境地漏中的单增李斯特菌生物被膜样品进行菌群结构分析。三种方法结果一致显示:3Q、5Q、6Q的优势菌为假单胞菌(Pseudomonas psychrophila)、假单胞菌（Pseudomonas sp.）和产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）;嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）和克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）分别是1-2、1-3和3-2的优势菌，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）是2-3的优势菌，嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）和假单胞菌（Pseudomonas sp.）是3-3的优势菌。同时，在DGGE谱图中显示，同一食品厂不同采集点的生物膜样品有相似的条带，表明在不同的采集点的菌群组成存在相似性且优势菌相同。
　　该研究分析了食品加工环境中单核增生李斯特菌生物被膜中菌群结构，这将为全面探讨工业加工环境中致病菌的生物被膜形成机制，以及致病菌生物被膜控制新靶点的研究奠定理论基础。

目录

摘要

英文缩写索引

第一章 绪论

1．1 消毒剂概述

1．2 细菌的生物被膜及其耐药机制

1．2．1 细菌的生物被膜

1．2．2 细菌生物被膜的耐药性机制

1．3 LM的检测方法

1．3．1 传统的分离鉴定方法

1．3．2 免疫学检测方法

1．3．3 传统的PCR检测方法

1．3．4 实时荧光定量PCR检测方法

1．4 细菌多样性的分析方法

1．4．1 16SrDNA克隆文库分析法

1．4．2 限制性片段长度多态性分析法

1．4．3 末端限制性片段长度多态性分析法

1．4．4 变性梯度凝胶电泳分析

1．4．5 高通量测序分析

1．5 国内外研究现状

1．6 本课题研究内容及目的

第二章 消毒环境生物被膜中LM的筛选与鉴定

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 菌株及来源

2．2．2 主要试剂与仪器

2．3 实验方法

2．3．1 样品采集

2．3．2 单核增生李斯特菌初步分离与鉴定

2．3．3 单核增生李斯特菌的形态学鉴定

2．3．4 单核增生李斯特菌的的PCR鉴定

2．4 结果分析

2．4．1 初步分离与鉴定结果

2．4．2 PCR鉴定结果

2．5 讨论

第三章 苯扎溴铵对单核增生李斯特菌的MIC测定

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 实验菌株

3．2．2 主要试剂与仪器

3．2．3 主要溶液与培养基的配置

3．3 实验方法

3．3．1 单核增生李斯特菌的活化

3．3．2 含药琼脂平板制备

3．3．3 接种物制备与接种

3．3．4 读取结果

3．4 结果与分析

3．5 讨论

第四章 基于16S rDNA基因的T-RFLP与克隆文库分析

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 实验样品

4．2．2 主要试剂与仪器

4．2．3 主要溶液与培养基的配置

4．3 实验方法

4．3．1 样品基因组DNA的提取

4．3．2 16S rDNA片段的PCR扩增及纯化

4．3．3 T-RFLP分析

4．3．4 16S rDNA克隆文库的构建

4．3．5 数据统计分析

4．4 结果与分析

4．4．1 总DNA的提取结果

4．4．2 1 6S rDNA的扩增结果

4．4．3 T-RFLP分析结果

4．4．4 16S rDNA文库分析结果

4．5 讨论

第五章 DGGE分析菌群结构及优势菌

5．1 引言

5．2 实验材料

5．2．1 实验样品

5．2．2 主要试剂与仪器

5．2．3 主要溶液与培养基的配置

5．3 实验方法

5．3．1 PCR扩增及纯化

5．3．2 DGGE胶的配制

5．3．3 DGGE(变性梯度凝胶电泳)

5．3．4 DGGE条带的回收及PCR扩增

5．3．5 回收条带克隆及测序

5．4 结果和分析

5．4．1 基因组DNA的16S rDNAV3区扩增

5．4．2 DGGE谱图分析

5．4．3 DNA测序结果及优势菌分析

5．5 讨论

结论与展望

参考文献

攻读学位期间发表的论文

声明

致谢