pIRES2-EGFP-hIL-12-HSP70真核表达载体的构建及对7402肝癌细胞生长的影响

摘要

目的:构建真核表达载体pIRES2-EGFP-hIL-12-HSP70,并观察其转染7402肝癌细胞后的表达情况及对7402肝癌细胞生长的影响,旨在获得同时具有hIL-12和HSP70活性的双功能融合蛋白分子。
　　 方法:应用聚合酶链反应(PCR)技术,从pBI121-hIL-12质粒中扩增hIL-12基因,从pShuttle-CMV-HSP70质粒中扩增HSP70基因,应用基因定向重组技术构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-hIL-12、pIRES2-EGFP-HSP70及pIRES2-EGFP-hIL-12-HSP70,并通过PCR、酶切和DNA测序进行鉴定。用Lipofectamine2000将以上各重组真核表达载体及pIRES2-EGFP(空白对照)质粒转染7402肝癌细胞,同时设空细胞组,各组分别命名为7402/hIL-12,7402/HSP70,7402/hIL-12-HSP70,7402/PE,7402/0。通过倒置荧光显微镜检测各组细胞的绿色荧光表达情况;Real-timePCR检测各重组外源基因在7402肝癌细胞中的表达差异;MTT法检测细胞生长情况;用AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。
　　 结果:真核表达载体pIRES2-EGFP-hIL-12、pIRES2-EGFP-HSP70及pIRES2-EGFP-hIL-12-HSP70构建成功,通过PCR扩增、酶切及DNA测序证实各插入基因及联合基因的大小、位置、方向均正确无误;各转染组细胞在转染后24h、48h、72h均可在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光;Real-timePCR证明各重组外源基因在已转染重组真核表达载体的7402肝癌细胞中均有表达。MTT法结果显示7402/hIL-12-HSP70组细胞的细胞抑制率最高,各处理组细胞48h抑制率明显高于24h和72h,7402/hIL-12-HSP70组细胞的细胞抑制率与7402/hIL-12组、7402/HSP70组、7402/PE组的差异均有显著性(P＜0.05)。AnnexinV-FITC/PI双染法结果显示7402/hIL-12-HSP70组细胞较其余各组细胞凋亡数量增多,7402/hIL-12-HSP70组细胞凋亡数量与7402/hIL-12组、7402/HSP70组、7402/PE组的差异均有显著性(P＜0.05)。
　　 结论:成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-hIL-12、pIRES2-EGFP-HSP70及pIRES2-EGFP-hIL-12-HSP70;各重组真核表达载体均能转染进7402肝癌细胞并有效表达;联合hIL-12和HSP70基因能明显地促进7402肝癌细胞凋亡,并具有协同增强作用。