BC047440基因反义真核表达载体的构建及其对肝癌细胞生长影响的研究

摘要

原发性肝癌是一种常见的恶性肿瘤，恶性程度高，预后很差，整个人群的肝癌5年生存率只有5％左右。 近年来的研究表明原发性肝癌的发生是一个多基因参与的，通过不同基因、在不同时相的差异表达进行调控的复杂过程。由于目前发现的与肝癌发生发展密切相关的基因较少，通过寻找、克隆肝癌新的相关基因，弄清其结构、功能，从基因水平认识肝癌发生的分子机制，对肝癌的基因诊断和基因治疗具有重要意义。 在先前的研究中，我们通过抑制消减杂交法(Suppressionsubtractivehybridization，SSH)对肝癌组织与癌旁肝组织之间差异表达的基因进行分离、鉴定，发现了1条新的基因cDNA片断(EST)，并克隆出该基因的全长cDNA序列。它与近期登录的基因BC047440同源。RT-PCR分析显示BC047440基因在肝癌组织中的表达强度明显高于正常肝组织或癌旁组织。 目的： 构建肝细胞癌高表达新基因BC047440的反义真核表达载体，探讨BC047440基因在肝细胞癌发生发展中的作用。 方法： 1.提取人原发性肝细胞癌组织总RNA，经逆转录酶-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增BC047440基因的cDNA片断，与pMD18-Tsimple载体连接，筛选、扩增、抽提质粒和双酶切后，将纯化的BC047440基因的cDNA片断反向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)质粒中，然后筛选、扩增、抽提质粒，从而构建BC047440基因的反义真核表达载体pcDNA3.1(+)BC047440AS，最后测序鉴定。 2.通过DOTAPTM脂质体介导的转染技术，将BC047440基因的反义真核表达载体导入肝癌细胞HepG2，经G418筛选，获得稳定表达BC047440反义基因的肝癌细胞HepG2-BC047440AS。设计转染pcDNA3.1(+)质粒的肝癌细胞HepG2-pcDNA3.1(+)及未转染的肝癌细胞HepG2作为对照组，采用半定量RT-PCR检测反义BC047440基因对HepG2-BC047440AS细胞的内源性BC047440基因表达的抑制效果，MTT比色法观察HepG2-BC047440AS细胞生长曲线变化，流式细胞术比较HepG2-BC047440AS细胞周期的变化以及裸鼠致瘤实验观察HepG2-BC047440AS细胞在裸鼠皮下致瘤能力的改变。 结果： 1.经RT-PCR获得长826bp含限制性内切酶位点的cDNA片段，T-载体克隆后经PCR扩增目的片段、测序，确定该片段为BC047440基因的cDNA(长809bp，60-859bp，BC047440基因CDS区为179-781bp)。构建的BC047440基因反义真核表达载体pcDNA3.1(+)BC047440AS经PCR鉴定及基因测序鉴定证实构建成功。 2.与对照组比较，半定量RT-PCR实验结果显示HepG2-BC047440AS细胞的内源性BC047440基因表达被抑制；MTT比色法实验结果显示HepG2-BC047440AS细胞的生长速度明显减慢；流式细胞术结果提示HepG2-BC047440AS细胞周期中G1期细胞比例明显增高；裸鼠致瘤实验显示HepG2-BC047440AS细胞在裸鼠皮下的致瘤能力明显下降。 结论： 1.成功克隆了人原发性肝细胞癌BC047440基因的cDNA片断。 2.成功构建了BC047440基因的反义真核表达载体：pcDNA3.1(+)BC047440AS，并筛选出转基因肝癌细胞株：HepG2-BC047440AS。 3.反义BC047440基因可以抑制肝癌细胞HepG2的生长，提示BC047440基因可能参与肝细胞癌的发生发展过程。

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摘要

前言

第一部分BC047440基因反义真核表达载体的构建

第二部分BC047440基因对肝癌细胞生长影响的研究

全文结论

致谢

文献综述肝癌基因治疗研究最新进展

硕士在读期间发表的文章