PI3K/Akt信号通路在体外培养血管瘤内皮细胞中的表达及调控

摘要

目的：观察PDKp110催化亚基及p-Akt、Akt在体外培养血管瘤内皮细胞中的表达，并对其进行调控，探讨PI3K/Akt信号通路在小儿血管瘤的发生、发展及消退过程中的作用。
　　 方法：
　　 1.用组织块结合酶消化法培养血管瘤内皮细胞，待长成单层细胞以后传代，建立血管瘤血管内皮细胞系，观察其增殖特征，绘制其生长曲线，并用第Ⅷ凝血因子相关抗原进行鉴定。
　　 2.同步化培养血管瘤内皮细胞，采用Western blotting检测血管瘤内皮细胞PI3Kp110、p-Akt及Akt蛋白表达水平，同期用流式细胞仪检测血管瘤血管内皮细胞周期的分布及凋亡率，并分析PI3Kp110、p-Akt与Akt表达水平与血管瘤血管内皮细胞周期的分布及细胞凋亡的相关性。
　　 3.待细胞处于对数生长期，换无血清培养液孵育48小时使细胞同步化，然后加入25μmol/LLY294002、10nmol/L雷帕霉素、1.0g/L的曲安奈德继续孵育24小时，细胞刮刀收集细胞，检测体外培养血管瘤内皮细胞中PI3Kp110催化亚基、p-Akt及Akt的表达水平，同时检测血管瘤内皮细胞周期分布及细胞凋亡率，并分析p110、p-Akt及Akt的表达水平与体外培养血管瘤内皮细胞周期分布及凋亡的相关性。
　　 结果：
　　 1.培养的血管瘤内皮细胞于4-5天后并始贴壁生长，一周后只有少量细胞铺展贴壁生长，两周后开始分裂增殖，三周后细胞开始快速生长，四周后细胞铺满瓶底。用相差倒置显微镜观察，发现所分离的内皮细胞呈上皮细胞形态，部分呈环状排列，并有铺路石样外观。培养细胞第Ⅷ凝血因子相关抗原表达为阳性。
　　 2.体外培养的血管瘤血管内皮细胞中有p110、p-Akt及Akt蛋白的表达。
　　 3.LY294002、雷帕霉素干预24小时后，p110及p-Akt蛋白表达水平较对照组下降：对照组p110(0.37±0.04)、p-Akt(0.22±0.02)；干预组LY294002 p110(0.19±0.01)、p-Akt(0.09±0.02)，雷帕霉素p110(0.15±0.00)、p-Akt(0.09±0.00)，与对照组比较，统计学差异均较大(P<0.01)；曲安奈德干预24小时后p110蛋白表达水平下降：p110(0.10±0.00)，与对照组比较，统计学差异较大(P<0.01)，而p-Akt蛋白未见表达；干预组细胞周期均阻滞于G0/G1期：对照组(60.88±6.23)％，LY294002(93.81±2.65)％、雷帕霉素(88.30±3.66)％，曲安奈德(92.93±0.01)％，干预前后有统计学差异(P<0.05)；凋亡细胞总数增加：对照组(0.51±0.03)％，LY294002(11.24±2.34)％，雷帕霉素(14.40±1.77)％，曲安奈德(9.98±0.67)％，与对照组比较，统计学差异较大(P<0.01)。而总Akt蛋白表达水平无变化。
　　 结论：
　　 1.体外培养血管瘤内皮细胞中有PI3Kp110、p-Akt及Akt表达。
　　 2.PI3K/Akt信号通路可能参与体外培养血管瘤内皮细胞凋亡的调控。
　　 3.LY294002、雷帕霉素、曲安奈德可能通过干预PI3K/Akt信号通路中相应的靶点，抑制p110激活，阻碍脂磷酸化，使体外培养血管瘤内皮细胞停滞于G0/G1期并诱导凋亡。