猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗构建及其免疫学特性研究

摘要

目的：本研究利用基因工程技术构建猪带绦虫重组 Bacillus Calmette-Guérin（BCG）-TSOL18疫苗，研究TSOL18基因在BCG中的表达情况；然后将重组BCG-TSOL18疫苗免疫昆明小鼠，动态观察免疫小鼠血清特异性IgG和IgG2a的变化规律，脾淋巴细胞增殖水平及脾淋巴细胞培养上清液IL-2和IL-4的水平，为该疫苗的进一步研究奠定基础。
　　方法：将本室制备保存的重组质粒pGEX-TSOL18经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后获得 TSOL18目的基因，再将其定向克隆至大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体 pMV261中，构建pMV261-TSOL18重组质粒，采用电穿孔法将该重组质粒转入BCG中，构建猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗，并进行PCR鉴定；将重组BCG-TSOL18疫苗经45℃热诱导表达，通过SDS-PAGE鉴定和Western blot分析重组TSOL18蛋白的表达情况。然后将80只昆明小鼠随机分成4组：①腹腔注射组，接种5×106克隆形成单位（CFU）重组BCG-TSOL18疫苗100μl；②口服灌胃组，接种4×108 CFU重组BCG-TSOL18疫苗100μl；③和④分别为BCG和PBS对照组。于疫苗免疫后0、2、4、6和8w，收集血清和脾淋巴细胞，采用 ELISA法检测血清特异性 IgG和 IgG2a水平及脾淋巴细胞培养上清液IL-2和IL-4水平；采用CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖水平。
　　结果：重组质粒pGEX-TSOL18经双酶切鉴定成功获得393bp TSOL18目的基因；重组质粒pMV261-TSOL18经双酶切、PCR和测序证实构建成功；重组BCG-TSOL18疫苗经PCR证实构建成功；SDS-PAGE证实重组质粒pMV261-TSOL18在BCG中经热诱导后能够表达相对分子质量（Mr）约为14.7kDa的重组TSOL18目的蛋白，Western blot分析示该重组蛋白有特异的抗原性。动态观察表明：疫苗腹腔注射组和口服灌胃组小鼠血清特异性IgG和IgG2a水平均在免疫后2～8w升高，均在免疫后6w达较高水平；脾淋巴细胞增殖水平均在免疫后2～8w升高，均在免疫后6w达较高水平；脾淋巴细胞培养上清液IL-2和IL-4水平均在免疫后2～8w和4～6w升高，均在免疫后6w和4w达较高水平。
　　结论：
　　1.成功构建了猪带绦虫重组质粒pMV261-TSOL18。
　　2.成功构建了猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗。
　　3.猪带绦虫TSOL18基因能在BCG中诱导表达，且表达的重组TSOL18蛋白具有特异的抗原性。
　　4.猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗可诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答。

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前言

第一章 猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗构建及其表达研究

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二章 猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗免疫学特性研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

综述: 寄生虫基因工程卡介苗疫苗研究进展

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