结核分枝杆菌休眠相关抗原Rv1733c DNA疫苗的构建及免疫学特性研究

摘要

目的 构建结核分枝杆菌(Mtb)休眠相关抗原Rv1733c的真核表达载体,并评价其作为DNA疫苗的免疫学特性.方法 利用限制性酶切的方法从本室前期保存的pMD-18T-Rv1733c质粒中构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c.将pcDNA-Rv1733c重组质粒稳定转染P815细胞,并用间接免疫荧光法检测Rv1733c的表达.采用数字表法随机将BALB/c小鼠分为3组,每组10只,即pcDNA-Rv1733c质粒DNA组、生理盐水组和BCG组.pcDNA-Rv1733c质粒DNA组和生理盐水组采用肌内注射方式免疫,间隔2周免疫1次,共免疫3次.BCG组采用皮下免疫一次.各组小鼠每2周采血,ELISA检测血清中特异性抗体水平和IgG2a/IgG1抗体亚类比率与比值.初次免疫8周后,MTS[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2 H-etrazolium,inner salt](四氮唑蓝盐化合物)法检测小鼠脾淋巴细胞特异性增殖、ELISPOT检测脾淋巴细胞分泌IFN-γ的水平.流式细胞法检测脾淋巴细胞中CD4+和CD8+T细胞所占比率；LDH法检测CTL(cytotoxic T lymphocytes;细胞毒性T淋巴细胞)活性.结果 成功构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c.间接免疫荧光实验表明pcDNA-Rv1733c质粒稳定转染的P815细胞中能够稳定表达Rv1733c蛋白.pcDNA-Rv1733c质粒DNA免疫小鼠后能诱导小鼠产生特异性抗体,抗体亚类以IgG2a为主,随着免疫时间的延长,IgG2a/IgG1的比值趋于平衡；脾淋巴细胞增殖指数(2.00±0.36)高于BCG组(1.1±0.06)(t=3.096,P＜0.05)；特异性分泌IFN-γ的脾淋巴细胞频数(41.48±5.30)SFC/ 106高于生理盐水组(2.75±1.37)SFC/106(t=4.752,P＜0.05)；然而脾淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞所占比率[分别为(18.15±2.30)％、(7.68±1.34)％]、CTL杀伤活性[(29.52±1.96)％]都与生理盐水组相当[(16.43±2.02)％ (t=0.571,P＞0.05)、(7.32±0.42)％(t=0.234,P＞0.05)、(25.28±2.51)％(t=0.726,P＞0.05)].结论 成功构建Rv1733c真核表达载体pcDNA-Rv1733c;并能够诱导小鼠机体产生特异性的体液和细胞免疫应答,提示用于结核病新型疫苗的研究具有一定的意义.