Cohn组分Ⅳ沉淀中血浆蛋白的分离工艺及过程自动化研究

摘要

本文研究了从血浆蛋白生产中的废弃物Cohn组分Ⅳ沉淀(CohnⅣ沉淀)中，分离纯化多种有药用价值血浆蛋白的工艺。主要目标为白蛋白(Albumin，HSA)、运铁蛋白(Transferrin，Tf)、α1-蛋白酶抑制剂(α1-antitrypsin，α1-AT)、抗凝血酶-Ⅲ(Antithrombin-Ⅲ，AT-Ⅲ)、结合珠蛋白(Haptoglobin，Hp)等五种血浆蛋白。根据沉淀法和多维层析法相结合的思路，设计分离工艺，首先对沉淀进行预处理，然后通过多维层析技术，实现了五种蛋白的便捷高效分离，并对其分离过程实现了自动化控制。
　　 首先研究CohnⅣ沉淀预处理方法，确定用生理盐水溶解，离心和过滤除去固体助滤剂，再用聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)对蛋白溶液进行沉淀，除去了分子量较大的蛋白杂质，得到CohnⅣ沉淀预处理液。
　　 其次研究CohnⅣ沉淀预处理液的初步层析方法。比较了其在凝胶过滤层析，疏水层析和离子交换层析上的分离效果。实验发现凝胶过滤层析和离子交换层析对这五种蛋白的分离效果不佳，无法起到初步筛分作用，而疏水层析的三个洗脱组分中的蛋白成分简单，便于进一步纯化。因此，选择了Octyl Sepharose4 Fast Flow(OctylFF)作为初步层析步骤，确定了阶段洗脱的梯度为：20％、50％、100％，得到三个洗脱组分：第一组分主要含Tf；第二组分主要含α1-AT，Hp和部分的Tf;第三组分主要含AT-Ⅲ和HSA。
　　 接下来对疏水层析的三个组分进一步层析纯化。第一组分经过DEAEFastFlow(DEAEFF)纯化，得到Tf产品活性收率为74％。第二组分用DEAEFF分离得到α1-AT产品和含Hp的组分，该组分再经过凝胶过滤层析得到Hp产品。α1-AT和Hp活性收率分别为62％和40％。第三组分用肝素亲和HeparinSepharose6FastFlow纯化得AT-Ⅲ和白蛋白产品，活性收率分别为65％和87％。
　　 最后使用多维组合层析系统，实现了这五种蛋白的自动化分离过程，得到的目标蛋白的活性收率如下：HSA为95％，AT-Ⅲ为70％，Tf为80％，α1-AT为65％，Hp为50％。相对于手动操作，各蛋白的活性回收率提高，工艺时间缩短了5倍。该系统是封闭管道联接，由软件自动控制，节省了人力物力，避免了操作中的污染，减少了蛋白的损失。

目录

文摘

英文文摘

声明

1文献综述

1.1人血浆蛋白质的概述

1.1.1人血浆蛋白质的组成

1.1.2血浆蛋白质的生理功能

1.1.3血浆蛋白质的医疗价值

1.1.4不同来源血浆蛋白制品的比较

1.1.5血浆蛋白质的市场价值

1.2血浆蛋白质的分离纯化方法

1.2.1低温乙醇法分离血浆蛋白

1.2.2层析法分离血浆蛋白

1.2.3低温乙醇法与层析法的比较

1.2.4低温乙醇法与层析法的结合使用

1.3 Cohn组分Ⅳ沉淀中血浆蛋白质的分离

1.3.1 Cohn Ⅳ沉淀中几种重要的血浆蛋白介绍

1.3.2 Cohn Ⅳ沉淀利用情况

1.4多维层析分离方法介绍

1.4.1蛋白分离中多维层析的应用

1.4.2蛋白分离中多维层析的自动化

1.4.3多柱组合层析高通量蛋白质分离设备简介

1.5研究设计思路

1.5.1　Cohn组分Ⅳ沉淀的回收利用

1.5.2沉淀法和多维层析法结合分离多种血浆蛋白

1.5.3实现自动化多维层析

2 Cohn组分Ⅳ沉淀的预处理及初步层析过程的优化

2.1实验材料和设备

2.1.1实验材料

2.1.2实验设备

2.2实验方法

2.2.1 Cohn Ⅳ沉淀悬液制备

2.2.2 Cohn Ⅳ沉淀预处理液制备

2.2.3高效凝胶过滤分析(size exclusion high performance liquid chromatography，SEHPLC)

2.2.4疏水层析对Cohn Ⅳ沉淀的初步柱层析的优化

2.2.5离子交换层析对Cohn Ⅳ沉淀的初步柱层析的优化

2.2.6检测方法

2.3结果与讨论

2.3.1 Cohn Ⅳ沉淀的预处理

2.3.2凝胶过滤层析对Cohn Ⅳ沉淀的分析

2.3.3疏水层析对Cohn Ⅳ沉淀层析的结果

2.3.4离子交换层析分离Cohn Ⅳ沉淀的结果

2.3.5 Cohn Ⅳ沉淀的初步层析的选择

2.4本章小结

3 Cohn组分Ⅳ沉淀的进一步层析分离纯化

3.1 Cohn Ⅳ沉淀疏水层析第一洗脱组分的层析

3.1.1实验材料和设备

3.1.2实验方法

3.1.3结果和讨论

3.2 Cohn Ⅳ沉淀疏水层析第二洗脱组分的柱层析

3.2.1实验材料和设备

3.2.2实验方法

3.2.3结果和讨论

3.3　Cohn Ⅳ沉淀疏水层析第三洗脱组分的柱层析

3.3.1实验材料和设备

3.3.2实验方法

3.3.3结果和讨论

3.4本章小结

4多维层析自动化分离Cohn组分Ⅳ沉淀中蛋白质

4.1实验材料和设备

4.2实验方法

4.2.1 Cohn Ⅳ沉淀预处理液的制备

4.2.2多柱组合层析高通量蛋白质分离设备中层析柱的安装

4.2.3对各层析柱进行平衡处理

4.2.4进行自动化层析

4.2.5进行层析柱清洗与保存

4.3实验结果和讨论

4.4本章小结

5总结与展望

5.1本研究工作的总结

5.2本研究工作的创新之处

5.3本研究工作的展望

参考文献

致谢