一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中纯化α1‑抗胰蛋白酶的方法

摘要

本发明公开了一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中纯化α1‑抗胰蛋白酶的方法，将Cohn组分Ⅳ沉淀依次经过Cohn组分Ⅳ沉淀溶解浓缩、PEG沉淀、一次病毒灭活、一次超滤浓缩、三次层析精制、冻干、二次病毒灭活，最终得到α1‑抗胰蛋白酶。本发明的方法以低温乙醇法生产白蛋白的废弃物——Cohn组分Ⅳ沉淀为起始原料制备AAT，有利于提高原料血浆的综合利用率。整个方法过程中采用PEG沉淀结合阴离子交换层析、两次蓝色染料亲和层析，可有效去除杂质蛋白，最终获得纯度大于95％的AAT制剂，比活大于3900U/mg。

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白纯化技术领域，特别是涉及一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中纯化α1-抗胰蛋白酶的方法。

背景技术

α1-抗胰蛋白酶(alpha 1-antitrypsin，AAT)是由394个氨基酸及3条寡糖侧链构成的单链糖蛋白，分子量为52kDa，等电点为4.8，活性位点位于358～359位的Met-Ser区域。70～80％的AAT由肝细胞合成分泌，此外，单核细胞、巨噬细胞、肺泡细胞也能产生少量的AAT。

AAT主要的生理功能为维持蛋白酶-抗蛋白酶系统的平衡，保护正常组织不受酶解损伤。正常人血浆中AAT的浓度为1.0～2.0mg/ml，低于0.5mg/ml时，则很难抵抗中性粒细胞脱颗粒释放的弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)，NE可降解肺泡结缔组织中的弹性纤维，任其发展将会导致肺气肿，慢性阻塞性肺疾病。AAT缺乏为常染色体显性遗传病，由瑞典医生Laurell和Eriksso在1963年发现，并将其命名为AAT缺乏症(alpha-1antitrypsindefiency，AATD)。常见的突变体为S型和Z型，Z型AAT还会形成多聚体，聚集在肝细胞的内质网上，最终引发肝炎、肝硬化、肝癌等疾病。临床上采用外源性AAT补充疗法以纠正AAT-NE的失衡，静脉输注AAT(60mg/kg/week)可使血浆中AAT的水平达到保护阈值，血清抗NE能力明显提高。

近年来，越来越多的研究表明AAT不仅是一种蛋白酶抑制剂，还能调节免疫、控制炎症及病原微生物感染。其中，对于AAT通过抑制炎症反应，延缓I型糖尿病发展、减少移植胰岛死亡数量的研究已进入临床试验阶段。

1987年，FDA批准了第一个血浆来源的AAT冻干制剂(Prolastin)上市，用于治疗先天性AAT缺乏的肺气肿患者。目前，共有6种AAT产品(Prolastin，Aralast，Zemaira，Prolastin-C，Aralast NP，Glassia)在售。上述AAT产品以低温乙醇法生产白蛋白的废弃物——Cohn Fraction(Cohn组分)Ⅳ沉淀为起始原料进行制备，除Zemaira外，其它5种AAT产品均先采用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)沉淀法或PEG结合ZnCl₂沉淀法粗纯；再由阴离子交换层析或阴、阳离子交换层析精制；巴氏病毒灭活法、纳米膜过滤、S/D法有效灭活或去除病毒，保证制品临床使用的安全性。

其中，Prolastin制备工艺的原型为Coan MH等人在1985年公布的纯化方法(Preparation and properties of alpha 1-proteinase inhibitor concentrate fromhuman plasma.Vox Sang.1985；48(6):333-42.)，该方法将Cohn组分Ⅳ-1沉淀重悬在pH8.2的Tris-HCl缓冲液中，采用PEG 3350分级沉淀法结合DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换层析制备AAT。Coan MH等人在已公布的专利(US4379087，US4439358)中选用分子量为3000-4000的PEG为沉淀剂，PEG的用量随溶液pH值的升高而增加。经PEG沉淀后杂蛋白被去除，AAT保留在上清中，阴离子交换层析可选择性洗脱AAT。上述纯化工艺以蔗糖和柠檬酸钠为保护剂进行巴氏病毒灭活，AAT终产品的纯度为60％。上述纯化工艺得到的产品纯度不高，且只包括一步病毒灭活工艺，无法保证终产品临床使用的安全性。

Lebing W等公开的专利(US6462180)中将PEG沉淀法与阴阳离子交换层析结合可提高AAT的纯度，结合在阴离子交换层析上的AAT被选择性洗脱下来，通过调节pH值和电导可使AAT保留在阳离子交换层析的穿透峰中，最后采用去污剂(Tween 20)、纳米膜过滤进行病毒灭活处理，AAT终产品的纯度为95％。专利申请CN102993298A中表明采用PEG沉淀法结合阴阳离子交换层析，病毒灭活工艺为S/D法和15nm膜过滤，可获得纯度为99-100％的AAT制剂(醋酸纤维膜电泳得到的纯度)。专利申请CN102180966A中显示Cohn组分Ⅳ-1沉淀溶解液先后进行冷乙醇沉淀，S/D法病毒灭活，PEG沉淀，两步阴离子交换层析，巴氏病毒灭活，最终得到纯度为96-99％的AAT终产品。以上纯化工艺均采用离子交换层析精制AAT，然而离子交换层析是利用蛋白在不同pH值条件下带电荷数不同，与层析介质的结合存在差异而进行分离的。蛋白的带电荷数归根结底取决于等电点的大小，白蛋白的等电点为4.7～4.9，与AAT(4.8)接近，因此，采用离子交换层析很难去除在Cohn组分Ⅳ沉淀中含量很高的白蛋白，严重影响AAT的纯度和比活。此外，SDS-PAGE图谱显示白蛋白与AAT的电泳位置接近(图3)，这使得含有白蛋白的AAT样品在进行SDS-PAGE分析时呈现一条蛋白带，图3中a泳道的样品为经纯化后的AAT混入20％的人血白蛋白，该样品与对照品AAT在电泳图上的位置基本相同，这也是上述纯化工艺很难去除白蛋白，却获得较高纯度的原因，也就是说三种纯化工艺得到的AAT测得的纯度并不准确。

朱威等发表文章(α1-抗胰蛋白酶制剂的制备及其病毒灭活，中国生物制品学杂志，2001，14(2)：97-101)对Cohn组分Ⅳ沉淀抽提液进行PEG、有机溶剂、等电点沉淀，通过阴离子交换层析及凝胶过滤获得了纯度为91.3±1.52％的AAT制剂，纯化倍数约27.42倍，巴氏病毒灭活法可有效灭活病毒。以下两项专利(CN101274956A，CN101747432A)提供的AAT制备方法同样采用阴离子交换层析及凝胶过滤精制AAT，病毒灭活方法分别为巴氏病毒灭活法结合干热法，S/D法结合D20纳米膜过滤。上述方法中均采用凝胶过滤纯化AAT，但是凝胶过滤是根据蛋白分子量大小进行分离的，白蛋白的分子量为66.5kDa，仍与AAT接近(52kDa)，因此，采用凝胶过滤仍然很难去除白蛋白。

Travis J等发表文章(Selective removal of albumin from plasma byaffinity chromatography.Clin Chim Acta.1973Nov 23；49(1):49-52.)发现一种蓝色染料Gibacron Blue F3GA可与白蛋白结合，将其偶联在琼脂糖上能去除血浆中96％的白蛋白，且不损失其他蛋白。Pannell R等发表文章(Isolation and properties of humanplasma alpha-1-proteinase inhibitor.Biochemistry.1974Dec17；13(26):5439-45.)采用Sepharose-Blue Dextran吸附白蛋白，结合硫酸铵沉淀、两步阴离子交换层析从全血中提取AAT。余健等发表文章(蓝琼脂糖珠在纯化人血清α1抗胰蛋白酶中的应用，中国生物化学与分子生物学报，1991，7(1):122-4.)采用一步硫酸铵沉淀粗纯，四步层析(蓝琼脂糖珠亲和层析、DEAE纤维素柱层析、Con A琼脂糖珠亲和层析、Sephacryl S-200凝胶过滤)精制AAT。上述AAT纯化方法引入亲和层析虽能有效去除白蛋白，但制备方法繁琐，不适于工艺生产。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，提供一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中纯化出高纯度的α1-抗胰蛋白酶的方法，将Cohn组分Ⅳ沉淀依次经过溶解浓缩、PEG沉淀、一次病毒灭活、一次超滤浓缩、三次层析精制、冻干、二次病毒灭活，最终得到α1-抗胰蛋白酶(AAT)。

所述三次层析精制为一次阴离子交换层析精制和两次蓝色染料亲和层析精制。

用所述阴离子交换层析精制中洗脱AAT的AAT洗脱液平衡蓝色染料亲和层析精制中的蓝色染料亲和层析柱，及用来洗脱AAT；优选的，用阴离子交换层析精制中平衡阴离子交换层析柱的平衡液洗脱去除未结合在柱上的转铁蛋白和白蛋白。

所述AAT洗脱液为含45-65mM NaCl的pH 5.0-5.4、10-50mM醋酸盐缓冲液；优选的，所述平衡液为pH 5.0-5.4、10-50mM醋酸盐缓冲液。

所述阴离子交换层析精制中首先用平衡液平衡阴离子交换层析柱，然后上样，之后先用同一平衡液冲洗阴离子交换层析柱以去除未结合在柱上的转铁蛋白和白蛋白，再用pH4.6-4.8、10-50mM醋酸盐缓冲液洗脱结合在柱上的白蛋白和维生素D结合蛋白，最后用AAT洗脱液洗脱AAT，得到AAT洗脱样品，整个纯化过程的流速为150-350cm/h；

阴离子交换层析柱的介质优选离子交换基团为二乙基氨基乙基(diethylaminoethyl，DEAE)的弱阴离子交换层析介质或离子交换基团为季胺基(quaternary ammonium group，Q)的强阴离子交换层析介质。

所述蓝色染料亲和层析精制中首先用所述AAT洗脱液平衡蓝色染料亲和层析柱，然后上样，之后用所述AAT洗脱液冲洗蓝色染料亲和层析柱以去除未与蓝色染料结合的AAT，得到AAT穿透样品，整个纯化过程的流速为70-120cm/h；

蓝色染料亲和层析柱的介质优选亲和配基为蓝色染料的亲和层析介质，如BlueSepharose 6Fast Flow；

优选的，两次所述蓝色染料亲和层析精制中二次蓝色染料亲和层析与一次蓝色染料亲和层析的柱体积比为1:(15-20)。

两次蓝色染料亲和层析精制可使用同一蓝色染料亲和层析柱；具体为：一次蓝色染料亲和层析结束后，用过的蓝色染料亲和层析柱用含0.5-1.0M KSCN的pH 5.0-8.5、10-50mM醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液洗脱结合在柱上的大分子(分子量＞180kDa)杂蛋白、转铁蛋白、白蛋白、维生素D结合蛋白。

所述一次病毒灭活中将PEG沉淀所得上清液的pH值调节至6.5-7.5，0.22μm滤膜过滤，加入磷酸三正丁酯和吐温-80使其终浓度分别为0.3％(w/v，g/100mL)、1％(w/v，g/100mL)，23-25℃恒温水浴6h进行S/D法病毒灭活处理，得到灭活上清液。

所述二次病毒灭活中将冻干所得AAT冻干品在99-100℃的水浴中进行干热法病毒灭活处理30min以灭活囊膜病毒和非囊膜病毒，得到最终的α1-抗胰蛋白酶。

具体包括以下步骤：

a)、Cohn组分Ⅳ沉淀溶解、浓缩：Cohn组分Ⅳ沉淀用8-10倍重量的水溶解，0-10℃搅拌2-4h，调节pH值至7.5-8.0，固液分离，弃固体，得到Cohn组分Ⅳ溶解液，将Cohn组分Ⅳ溶解液超滤浓缩4-10倍体积得到Cohn组分Ⅳ浓缩液，Cohn组分Ⅳ浓缩液中的蛋白含量为20-40mg/ml；

b)、PEG沉淀：调节步骤a)所得Cohn组分Ⅳ浓缩液的pH值至5.0-5.4，0-10℃加入PEG 4000至其终浓度为10-15％(w/v，g/100ml)，搅拌使PEG 4000完全溶解，0-10℃静置后4000-6000g下离心20-60min，弃去包含大分子(分子量＞180kDa)杂蛋白、转铁蛋白、白蛋白和维生素D结合蛋白的沉淀，取上清液；

c)、一次病毒灭活：将步骤b)所得上清液的pH值调节至6.5-7.5，0.22μm滤膜过滤，加入磷酸三正丁酯(tri-n-butyl phosphate，TNBP)和吐温-80(Tween 80)使其终浓度分别为0.3％(w/v，g/100mL)、1％(w/v，g/100mL)，23-25℃恒温水浴6h进行S/D法病毒灭活处理，得到灭活上清液；

d)、一次超滤浓缩：用pH 5.0-5.4、10-50mM醋酸盐缓冲液超滤步骤c)所得灭活上清液，得到超滤液，超滤膜的截留分子量为20-30kDa；

e)、阴离子交换层析精制：采用阴离子交换层析纯化步骤d)所得超滤液；阴离子交换层析介质可选用离子交换基团为二乙基氨基乙基(diethylaminoethyl，DEAE)的弱阴离子交换层析介质或离子交换基团为季胺基(quaternary ammonium group，Q)的强阴离子交换层析介质；首先用pH 5.0-5.4、10-50mM醋酸盐缓冲液作为平衡液平衡阴离子交换层析柱，然后将步骤d)所得超滤液上样，之后先用同一平衡液冲洗未结合在柱上的转铁蛋白和白蛋白，再用pH4.6-4.8、10-50mM醋酸盐缓冲液洗脱结合在柱上的白蛋白和维生素D结合蛋白，最后用含45-65mM NaCl的平衡液作为AAT洗脱液洗脱AAT，得到AAT洗脱样品，整个纯化过程的流速为150-350cm/h；

f)、一次蓝色染料亲和层析精制：采用蓝色染料亲和层析纯化步骤e)所得AAT洗脱样品；蓝色染料亲和层析介质可选用亲和配基为蓝色染料的亲和层析介质，如BlueSepharose 6Fast Flow；首先用AAT洗脱液平衡蓝色染料亲和层析柱，然后将步骤e)所得AAT洗脱样品上样，之后用AAT洗脱液冲洗未与蓝色染料结合的AAT，得到一次AAT穿透样品，整个纯化过程的流速为70-120cm/h；用过的蓝色染料亲和层析柱可用含0.5-1.0M KSCN的pH 5.0-8.5、10-50mM醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液洗脱结合在柱上的大分子(分子量＞180kDa)杂蛋白、转铁蛋白、白蛋白、维生素D结合蛋白，然后重复利用；

g)、二次蓝色染料亲和层析精制：首先用AAT洗脱液平衡蓝色染料亲和层析柱，蓝色染料亲和层析介质同步骤f)；然后将步骤f)所得一次AAT穿透样品上样，之后用AAT洗脱液冲洗未与蓝色染料结合的AAT，得到二次AAT穿透样品；步骤g)与步骤f)中蓝色染料亲和层析柱的柱体积比为1:(15-20)；

h)、冻干：超滤浓缩步骤g)所得二次AAT穿透样品，使该样品的蛋白含量达到10-20mg/ml，然后加入保护剂组氨酸，组氨酸终浓度为0.05-0.1M，0.22μm滤膜过滤除菌，分装，冻干，得到AAT冻干品；

i)、二次病毒灭活：将步骤h)所得AAT冻干品在99-100℃的水浴中进行干热法病毒灭活处理30min，得到最终的α1-抗胰蛋白酶(AAT)。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的方法以低温乙醇法生产白蛋白的废弃物——Cohn组分Ⅳ沉淀为起始原料制备AAT，有利于提高原料血浆的综合利用率。整个方法过程中采用PEG沉淀结合阴离子交换层析、两次蓝色染料亲和层析，可有效去除大分子(分子量＞180kDa)杂蛋白、转铁蛋白、白蛋白、维生素D结合蛋白，最终获得高纯度的AAT制剂，得到的终产品纯度大于95％，以胰蛋白酶为抑制靶酶，比活大于3900U/mg。该方法中两次蓝色染料亲和层析层析条件相同，且平衡液与阴离子交换层析AAT的洗脱液相同，避免了多种溶液配制带来的不便。此外，本发明方法中减少了超滤浓缩步骤，简化了生产过程，适于规模化制备AAT。最后本发明方法采用可有效灭活囊膜病毒的S/D法，及可有效灭活囊膜病毒和非囊膜病毒的干热法两步不同原理的病毒灭活工艺，保证了AAT制剂的病毒安全性。

附图说明

图1所示为本发明方法的流程图；

图2所示为Cohn组分Ⅳ沉淀溶解液电泳图，其中：M为蛋白Marker，a为Cohn组分Ⅳ沉淀溶解液；

图3所示为AAT与白蛋白电泳位置对比图，其中：M为蛋白Marker，a为实施例3得到的AAT中混入20％的人血白蛋白的混合物，B为人血白蛋白(CSL Behring)，A为Sigma公司提供的AAT标准品；

图4所示为实施例1中PEG沉淀后得到的PEG上清液、PEG沉淀和超滤浓缩后得到的超滤液的电泳图，其中：M为蛋白Marker，a为Cohn组分Ⅳ沉淀溶解液，b为PEG上清液，c为PEG沉淀，d为超滤液；

图5所示为实施例2中阴离子交换层析纯化后得到的穿透样品、pH 4.7洗脱样品、50mM NaCl AAT洗脱样品的电泳图，其中：M为蛋白Marker，a为Cohn FⅣ沉淀溶解液，b为PEG上清液，c为PEG沉淀，d为超滤液，e为穿透样品，f为pH 4.7洗脱样品，g为50mM NaCl AAT洗脱样品，h为100M NaCl洗脱样品；

图6所示为实施例3中两次蓝色染料亲和层析纯化后得到的pH 5.4AAT穿透样品、0.5M KSCN洗脱样品的电泳图，其中：M为蛋白Marker，a为45mM NaCl AAT洗脱样品超滤液，b为第一次pH 5.4AAT穿透样品，c为第一次0.5M KSCN洗脱样品，d为第二次pH 5.4AAT穿透样品，e为第二次0.5M KSCN洗脱样品，A为Sigma公司提供的AAT标准品，B为人血白蛋白(CSLBehring)；

图7所示为实施例2中整个分离纯化方法得到的PEG上清超滤液、阴离子交换层析50mM NaCl AAT洗脱样品、第一次蓝色染料亲和层析pH 5.2AAT穿透样品、第二次蓝色染料亲和层析pH 5.2AAT穿透样品的电泳图，其中：M为蛋白Marker，a为Cohn FⅣ沉淀溶解液，b为PEG上清超滤液，c为阴离子交换层析50mM NaCl AAT洗脱样品，d为第一次蓝色染料亲和层析pH 5.2AAT穿透样品，e为第二次蓝色染料亲和层析pH5.2AAT穿透样品，A为Sigma公司提供的AAT标准品；

图8所示为高效液相分析图谱，进样样品为实施例3中第二次蓝色染料亲和层析纯化所得pH 5.4AAT穿透样品；

图9所示为高效液相分析图谱，进样样品为Sigma公司提供的AAT标准品；

图10所示为比较例1中阴离子交换层析纯化所得50mM NaCl穿透样品、100mM NaClAAT洗脱样品的电泳图，其中：M为蛋白Marker，a为Cohn组分Ⅳ沉淀溶解液，b为PEG上清液，c为PEG沉淀，d为超滤液，e为50mM NaCl穿透样品，f为100mM NaCl AAT洗脱样品；

图11所示为比较例2中阴离子交换层析纯化所得25mM NaCl洗脱样品、50mM NaCl洗脱样品、100mM NaCl AAT洗脱样品、150mM NaCl洗脱样品、200mM NaCl洗脱样品的电泳图，其中：M为蛋白Marker，a为Cohn组分Ⅳ沉淀溶解液，b为PEG上清超滤液，c为穿透样品，d为25mM NaCl洗脱样品，e为50mM NaCl洗脱样品，f为100mM NaCl AAT洗脱样品，g为150mMNaCl洗脱样品，h为200mM NaCl洗脱样品；

图12所示为比较例3中蓝色染料亲和层析所得pH 6.5AAT穿透样品、0.5M KSCN洗脱样品的电泳图，其中：M为蛋白Marker，a为Cohn FⅣ沉淀溶解液，b为PEG上清液，c为PEG沉淀，d为超滤液，e为阴离子交换层析穿透样品，f为pH 4.7洗脱样品，g为55mM NaCl AAT洗脱样品，h为100M NaCl洗脱样品，i为AAT洗脱样品超滤液，g为得pH 6.5AAT穿透样品，h为0.5MKSCN洗脱样品。

具体实施方式

本发明提供的从Cohn组分Ⅳ沉淀中纯化α1-抗胰蛋白酶的方法，见图1，包括以下步骤：

a)、Cohn组分Ⅳ沉淀溶解、浓缩：Cohn组分Ⅳ沉淀用8-10倍重量的水溶解，0-10℃搅拌2-4h，调节pH值至7.5-8.0，固液分离，弃固体，得到Cohn组分Ⅳ溶解液，将Cohn组分Ⅳ溶解液超滤浓缩4-10倍体积得到Cohn组分Ⅳ浓缩液，Cohn组分Ⅳ浓缩液中的蛋白含量为20-40mg/ml；

b)、PEG沉淀：调节步骤a)所得Cohn组分Ⅳ浓缩液的pH值至5.0-5.4，0-10℃加入PEG 4000至其终浓度为10-15％(w/v，g/100ml)，搅拌使PEG 4000完全溶解，0-10℃静置后4000-6000g下离心20-60min，弃去包含大分子(分子量＞180kDa)杂蛋白、转铁蛋白、白蛋白和维生素D结合蛋白的沉淀，取上清液；

c)、一次病毒灭活：将步骤b)所得上清液的pH值调节至6.5-7.5，0.22μm滤膜过滤，加入磷酸三正丁酯(tri-n-butyl phosphate，TNBP)和吐温-80(Tween 80)使其终浓度分别为0.3％(w/v，g/100mL)、1％(w/v，g/100mL)，23-25℃恒温水浴6h进行S/D法病毒灭活处理，得到灭活上清液；

d)、一次超滤浓缩：用pH 5.0-5.4、10-50mM醋酸盐缓冲液超滤步骤c)所得灭活上清液，得到超滤液，超滤膜的截留分子量为20-30kDa；

e)、阴离子交换层析精制：采用阴离子交换层析纯化步骤d)所得超滤液；阴离子交换层析介质可选用离子交换基团为二乙基氨基乙基(diethylaminoethyl，DEAE)的弱阴离子交换层析介质或离子交换基团为季胺基(quaternary ammonium group，Q)的强阴离子交换层析介质；首先用pH 5.0-5.4、10-50mM醋酸盐缓冲液作为平衡液平衡阴离子交换层析柱，然后将步骤d)所得超滤液上样，之后先用平衡液冲洗未结合在柱上的转铁蛋白和白蛋白，再用pH4.6-4.8、10-50mM醋酸盐缓冲液洗脱结合在柱上的白蛋白和维生素D结合蛋白，最后用含45-65mM NaCl的平衡液洗脱AAT，得到AAT洗脱样品，整个纯化过程的流速为150-350cm/h。

f)、一次蓝色染料亲和层析精制：采用蓝色染料亲和层析纯化步骤e)所得AAT洗脱样品；蓝色染料亲和层析介质可选用亲和配基为蓝色染料的亲和层析介质，如BlueSepharose 6Fast Flow；首先用含45-65mM NaCl的平衡液平衡蓝色染料亲和层析柱，然后将步骤e)所得AAT洗脱样品上样，之后用含45-65mM NaCl的平衡液冲洗未与蓝色染料结合的AAT，得到一次AAT穿透样品，整个纯化过程的流速为70-120cm/h；用过的蓝色染料亲和层析柱可用含0.5-1.0M KSCN的pH 5.0-8.5、10-50mM醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液洗脱结合在柱上的大分子(分子量＞180kDa)杂蛋白、转铁蛋白、白蛋白、维生素D结合蛋白，然后重复利用；

g)、二次蓝色染料亲和层析精制：首先用含45-65mM NaCl的平衡液平衡蓝色染料亲和层析柱，蓝色染料亲和层析介质同步骤f)；然后将步骤f)所得一次AAT穿透样品上样，之后用含45-65mM NaCl的平衡液冲洗未与蓝色染料结合的AAT，得到二次AAT穿透样品；步骤g)与步骤f)中蓝色染料亲和层析柱的柱体积比为1:(15-20)。

h)、冻干：超滤浓缩步骤g)所得二次AAT穿透样品，使该样品的蛋白含量达到10-20mg/ml，然后加入保护剂组氨酸，组氨酸终浓度为0.05-0.1M，0.22μm滤膜过滤除菌，分装，冻干，得到AAT冻干品。

i)、二次病毒灭活：将步骤h)所得AAT冻干品在99-100℃的水浴中进行干热法病毒灭活处理30min，得到最终的α1-抗胰蛋白酶(AAT)产品。

以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。

实施例1

a)、Cohn组分Ⅳ沉淀溶解、浓缩：200g Cohn组分Ⅳ沉淀用2000ml水溶解，4℃搅拌3h，调节pH值至7.5，离心去除硅藻土，得到Cohn组分Ⅳ溶解液(电泳图见图2)。将Cohn组分Ⅳ溶解液超滤浓缩4倍体积至500ml，得到Cohn组分Ⅳ浓缩液，蛋白含量为20-22mg/ml。

b)、PEG沉淀：调节Cohn组分Ⅳ浓缩液pH值至5.0，4℃条件下边搅拌边加入50g PEG4000至其终浓度为10％(w/v，g/100ml)，加完后继续搅拌30-45min使PEG4000充分溶解；4℃静置30-45min，6000g离心20min，弃去沉淀，取上清液；沉淀中包括大分子(分子量＞180kDa)杂蛋白、转铁蛋白、白蛋白和维生素D结合蛋白(见图4)。

c)、一次病毒灭活：S/D法病毒灭活，上清液用0.5M NaOH调节pH值至6.5，经0.22μm滤膜过滤后，加入S/D试剂(由3％TNBP和10％Tween 80组成)使TNBP、Tween 80的终浓度分别为0.3％、1％(w/v,g/100ml)，24℃恒温水浴6h，得到灭活上清液。

d)、一次超滤浓缩：灭活上清液用pH 5.0 10mM醋酸盐缓冲液超滤5-10个体积，得到超滤液，超滤膜的截留分子量为30kDa。

e)、阴离子交换层析精制：阴离子交换层析纯化，DEAE Sepharose Fast Flow弱阴离子交换层析柱(柱体积30ml)用pH 5.0 10mM醋酸盐缓冲液作为平衡液平衡8-10个柱体积，然后上样超滤液，之后先用平衡液冲洗未结合在柱上的转铁蛋白和白蛋白，再用pH 4.610mM醋酸盐缓冲液洗脱结合在柱上的白蛋白和维生素D结合蛋白，最后用含65mM NaCl的平衡液洗脱结合在柱上的AAT，得到AAT洗脱样品，整个纯化过程的流速为150cm/h。

f)、一次蓝色染料亲和层析精制：蓝色染料亲和层析纯化，Blue Sepharose 6FastFlow蓝色染料亲和层析柱(柱体积20ml)用含65mM NaCl的平衡液平衡8-10个柱体积，然后上样AAT洗脱样品，之后用含65mM NaCl的平衡液冲洗未结合在柱上的AAT，得到一次AAT穿透样品，整个纯化过程的流速为70cm/h；最后用含0.5M KSCN的pH 5.010mM醋酸盐缓冲液洗脱结合在柱上的大分子(分子量＞180kDa)杂蛋白、转铁蛋白、白蛋白和维生素D结合蛋白后，该层析柱可重复利用。

g)、二次蓝色染料亲和层析精制：同步骤f)，仅是柱体积为1ml，上样样品为一次AAT穿透样品，得到二次AAT穿透样品。

h)、冻干：二次AAT穿透样品超滤浓缩至蛋白含量为10-11mg/ml，超滤膜的截留分子量为30kDa；加入保护剂组氨酸，使其终浓度为0.05M，0.22μm滤膜过滤除菌，分装，冻干，得到AAT冻干品。

i)、二次病毒灭活：AAT冻干品在99-100℃的水浴中进行干热法病毒灭活处理30min，得到最终的α1-抗胰蛋白酶(AAT)产品。

用实施例1方法纯化α1-抗胰蛋白酶的各步骤中所得样品的指标见表1。

表1各步骤得到样品中的AAT活性、蛋白含量及比活

SDS-PAGE灰度扫描显示实施例1得到的AAT产品的纯度为99.08％，以胰蛋白酶为AAT抑制的靶酶，采用发色底物法测定终产品的活性为42638.28U/ml，BCA法测定蛋白含量为10.17mg/ml，AAT产品的比活为4192.55U/mg，纯化倍数为68.90倍。

实施例2

a)、Cohn组分Ⅳ沉淀溶解、浓缩：1.2kg Cohn组分Ⅳ沉淀用10.8L水溶解，0℃搅拌4h，用0.5M NaOH调节pH值至7.8，利用压滤机进行固液分离去除硅藻土，得到Cohn组分Ⅳ溶解液。将Cohn组分Ⅳ溶解液超滤浓缩7倍体积至2L，得到Cohn组分Ⅳ浓缩液，蛋白含量为29-31mg/ml。

b)、PEG沉淀：Cohn组分Ⅳ浓缩液用0.5M HCl调节pH值至5.2，0℃条件下边搅拌边加入300g PEG 4000至其终浓度为15％(w/v，g/100ml)，加完后继续搅拌30-45min使PEG4000充分溶解；0℃静置30-45min，4000g离心30min，弃去沉淀，取上清液。

c)、一次病毒灭活：S/D法病毒灭活，上清液用0.5M NaOH调节pH值至7.0，经0.22μm滤膜过滤后，加入S/D试剂(由3％TNBP和10％Tween 80组成)使TNBP、Tween 80的终浓度分别为0.3％、1％(w/v,g/100ml)，25℃恒温水浴6h，得到灭活上清液。

d)、一次超滤浓缩：灭活上清液用pH 5.2 20mM醋酸盐缓冲液超滤5-10个体积，得到超滤液，超滤膜的截留分子量为30kDa。

e)、阴离子交换层析精制：阴离子交换层析纯化，Q Sepharose Fast Flow强阴离子交换层析柱(柱体积150ml)用pH 5.2 20mM醋酸盐缓冲液作为平衡液平衡8-10个柱体积，然后上样超滤液，之后先用平衡液冲洗未结合在柱上的转铁蛋白和白蛋白，再用pH 4.720mM醋酸盐缓冲液洗脱结合在柱上的白蛋白和维生素D结合蛋白，最后用含50mM NaCl的平衡液洗脱结合在柱上的AAT，得到AAT洗脱样品(图5)，整个纯化过程的流速为350cm/h。

f)、一次蓝色染料亲和层析精制：蓝色染料亲和层析纯化，Blue Sepharose 6FastFlow蓝色染料亲和层析柱(柱体积80ml)用含50mM NaCl的平衡液平衡8-10个柱体积，然后上样AAT洗脱样品，之后用含50mM NaCl的平衡液冲洗未结合在柱上的AAT，得到一次AAT穿透样品，整个纯化过程的流速为100cm/h；最后用含1M KSCN的pH 7.020mM磷酸盐缓冲液洗脱结合在柱上的大分子(分子量＞180kDa)杂蛋白、转铁蛋白、白蛋白和维生素D结合蛋白后，该层析柱可重复利用。

g)、二次蓝色染料亲和层析精制：同步骤f)，仅是柱体积为4ml，上样样品为一次AAT穿透样品，得到二次AAT穿透样品。

h)、冻干：二次AAT穿透样品超滤浓缩至蛋白含量为15-16mg/ml，超滤膜的截留分子量为30kDa；加入保护剂组氨酸，使其终浓度为0.07M，0.22μm滤膜过滤除菌，分装，冻干，得到AAT冻干品。

i)、二次病毒灭活：AAT冻干品在99-100℃的水浴中进行干热法病毒灭活处理30min，得到最终的α1-抗胰蛋白酶(AAT)产品。

用实施例2方法纯化α1-抗胰蛋白酶的各步骤中所得样品的指标见表2。实施例2方法中步骤b)得到的上清液、步骤e)得到的AAT洗脱样品、步骤f)得到的一次AAT穿透样品、步骤g)得到的二次AAT穿透样品的电泳图见图7。

表2各步骤得到样品中的AAT活性、蛋白含量及比活

SDS-PAGE灰度扫描显示AAT终产品的纯度为98.17％，以胰蛋白酶为AAT抑制的靶酶，采用发色底物法测定终产品的活性为61940.16U/ml，BCA法测定蛋白含量为15.55mg/ml，AAT终产品的比活为3983.29IU/mg，纯化倍数为66.05倍。

实施例3

a)、Cohn组分Ⅳ沉淀溶解、浓缩：4kg Cohn组分Ⅳ沉淀用32L水溶解，10℃搅拌2h，用0.5M NaOH调节pH值至8.0，利用压滤机进行固液分离去除硅藻土，得到Cohn组分Ⅳ溶解液。将Cohn组分Ⅳ溶解液超滤浓缩10倍体积至3.6L，得到Cohn组分Ⅳ浓缩液，蛋白含量为38-40mg/ml。

b)、PEG沉淀：Cohn组分Ⅳ浓缩液用0.5M HCl调节pH值至5.5，10℃条件下边搅拌边加入432g PEG 4000至其终浓度为12％(w/v，g/100ml)，加完后继续搅拌3-4h使PEG 4000充分溶解；10℃静置过夜，4000g离心60min，弃去沉淀，取上清液。

c)、一次病毒灭活：S/D法病毒灭活，上清液用0.5M NaOH调节pH值至7.5，经0.22μm滤膜过滤后，加入S/D试剂(由3％TNBP和10％Tween 80组成)使TNBP、Tween 80的终浓度分别为0.3％、1％(w/v,g/100ml)，23℃恒温水浴6h，得到灭活上清液。

d)、一次超滤浓缩：灭活上清液用pH 5.4 50mM醋酸盐缓冲液超滤5-10个体积，得到超滤液，超滤膜的截留分子量为20kDa。

e)、阴离子交换层析精制：阴离子交换层析纯化，Q Sepharose Fast Flow强阴离子交换层析柱(柱体积500ml)用pH 5.4 50mM醋酸盐缓冲液作为平衡液平衡8-10个柱体积，然后上样超滤液，之后先用平衡液冲洗未结合在柱上的转铁蛋白和白蛋白，再用pH 4.850mM醋酸盐缓冲液洗脱结合在柱上的白蛋白和维生素D结合蛋白，最后用含45mM NaCl的平衡液洗脱结合在柱上的AAT，得到AAT洗脱样品，整个纯化过程的流速为250cm/h。为了便于下一步的层析纯化，将AAT洗脱样品用含45mM NaCl的平衡液超滤浓缩10倍体积后作为下一步亲和层析的上样样品。

f)、一次蓝色染料亲和层析精制：蓝色染料亲和层析纯化，Blue Sepharose 6FastFlow蓝色染料亲和层析柱(柱体积300ml)用含45mM NaCl的平衡液平衡8-10个柱体积，然后上样AAT洗脱样品，之后用含45mM NaCl的平衡液冲洗未结合在柱上的AAT，得到一次AAT穿透样品，整个纯化过程的流速为120cm/h；最后用含0.5M KSCN的pH 8.550mM Tris-HCl缓冲液洗脱结合在柱上的大分子(分子量＞180kDa)杂蛋白、转铁蛋白、白蛋白和维生素D结合蛋白后，该层析柱可重复利用。

g)、二次蓝色染料亲和层析精制：同步骤f)，仅是柱体积为20ml，上样样品为一次AAT穿透样品，得到二次AAT穿透样品；用含0.5M KSCN的pH 8.5 50mM Tris-HCl缓冲液洗脱结合在柱上的大分子(分子量＞180kDa)杂蛋白、转铁蛋白、白蛋白和维生素D结合蛋白后(图6)，该层析柱可重复利用。

h)、冻干：二次AAT穿透样品超滤浓缩至蛋白含量为20-21mg/ml，超滤膜的截留分子量为20kDa；加入保护剂组氨酸，使其终浓度为0.1M，0.22μm滤膜过滤除菌，分装，冻干，得到AAT冻干品。

i)、二次病毒灭活：AAT冻干品在99-100℃的水浴中进行干热法病毒灭活处理30min，得到最终的α1-抗胰蛋白酶(AAT)产品。

用实施例3方法纯化α1-抗胰蛋白酶的各步骤中所得样品的指标见表3。

表3各步骤得到样品中的AAT活性、蛋白含量及比活

SDS-PAGE灰度扫描显示AAT终产品的纯度为95.54％，以胰蛋白酶为AAT抑制的靶酶，采用发色底物法测定终产品的活性为80206.92IU/ml，BCA法测定蛋白含量为20.38mg/ml，AAT终产品的比活为3935.57IU/mg，纯化倍数为66.34倍。

质谱鉴定：

将二次AAT穿透样品先进行10％SDS-PAGE分析，染色后将目标蛋白条带切割成1mm²的胶粒，通过胶内酶解，提取肽段；采用Thermo>

Mascot检索到74种蛋白，排名前6位的蛋白如表4所示。

表4 AAT质谱鉴定结果

由表4的结果可知，Alpha-1-antitrypsin排名第一，峰面积最大，达到1.40E+11，Mascot打分值最高，为35070.4。排名前6位的蛋白中未出现转铁蛋白、白蛋白、维生素D结合蛋白，说明该纯化方法能有效去除上述杂蛋白，得到AAT。

高效液相色谱分析：

采用RIGOL L-3000高效液相分析二次AAT穿透样品是否为单一组分，对照品为Sigma公司购买的AAT标准品，上样30μg，色谱条件如下：

色谱柱：C4-ST2柱(4.6mm×50mm，5um C4填料)

流动相：A：2％乙腈/98％H₂O/0.1％三氟乙酸；

B:2％H₂O/98％乙腈/0.1％三氟乙酸；

流速：0.7μl/min

检测波长：280nm

洗脱条件：

time0537424550％B55959555

结果见图8和图9。图8和图9的高效液相图谱显示二次AAT穿透样品在保留时间28.5385min处出现一个单一的主峰，对照品AAT标准品在保留时间24.273min、28.7635min处出现两个峰，说明采用本发明方法纯化所得AAT的纯度高于对照品AAT标准品。

比较例1

a)Cohn组分Ⅳ沉淀溶解、浓缩：同实施例1。

b)、PEG沉淀：同实施例1。

c)、一次病毒灭活：无。

d)、一次超滤浓缩：同实施例1。

e)、阴离子交换层析精制：阴离子交换层析纯化，DEAE Sepharose Fast Flow弱阴离子交换层析柱(柱体积30ml)用含50mM NaCl的pH 6.5 25mM磷酸盐缓冲液作为平衡液平衡8-10个柱体积，然后上样超滤液，之后先用含50mM NaCl的平衡液冲洗未结合在柱上的转铁蛋白和白蛋白和维生素D结合蛋白，最后用含100mM NaCl的平衡液洗脱结合在柱上的AAT，得到AAT洗脱样品，整个纯化过程的流速为150cm/h。

f)、一次蓝色染料亲和层析精制：无。

g)、二次蓝色染料亲和层析精制：无。

h)、冻干：无。

i)、二次病毒灭活：无。

以胰蛋白酶为AAT抑制的靶酶，采用发色底物法测定终产品的活性，BCA法测定蛋白含量，计算比活，比较例1各步骤中所得样品的指标见表5。

表5各步骤得到样品中的AAT活性、蛋白含量及比活

由表5的活性测定结果可知，在pH 6.5条件下平衡DEAE Sepharose Fast Flow弱阴离子交换层析柱，AAT需要用含100mM NaCl的缓冲液才能洗脱下来，本发明用含65mMNaCl的缓冲液就能洗脱下来，比较例1用的洗脱液中含盐量比本发明高得多，且得到的AAT洗脱样品中虽然蛋白活性、含量及比活均高于本发明，但SDS-PAGE显示洗脱下来的蛋白中杂带多，即杂蛋白含量高，AAT纯度低。

由SDS-PAGE分析结果(见图10)可知，AAT洗脱样品中含有转铁蛋白、白蛋白和维生素D结合蛋白，含100mM NaCl的缓冲液在洗脱AAT的同时也洗脱下部分大分子(分子量＞180kDa)杂蛋白，且转铁蛋白的残留较多，纯化效果不如本发明中先进行低pH值(pH 4.6-pH4.8)洗脱杂蛋白，再增加盐浓度(45-65mM NaCl)洗脱AAT(见图5)。

比较例2

a)Cohn组分Ⅳ沉淀溶解、浓缩：同实施例1。

b)、PEG沉淀：同实施例1。

c)、一次病毒灭活：无。

d)、一次超滤浓缩：同实施例1。

e)、阴离子交换层析精制：阴离子交换层析纯化，Q Sepharose Fast Flow强阴离子交换层析柱(柱体积30ml)用pH 5.2 25mM醋酸盐缓冲液作为平衡液平衡8-10个柱体积，然后上样超滤液，之后先用平衡液冲洗未结合在柱上的转铁蛋白和白蛋白，再分别用含25mM NaCl的平衡液、含50mM NaCl的平衡液、含100mM NaCl的平衡液、含150mM NaCl的平衡液、含200mM NaCl的平衡液分步洗脱结合在柱上的蛋白，收集各洗脱样品，得到AAT洗脱样品，整个纯化过程的流速为150cm/h。

f)-i)、一次蓝色染料亲和层析精制、二次蓝色染料亲和层析精制、冻干、二次病毒灭活：无。

以胰蛋白酶为AAT抑制的靶酶，采用发色底物法测定终产品的活性，BCA法测定蛋白含量，计算比活，比较例2各步骤中所得样品的指标见表6。

表6各步骤得到样品中的AAT活性、蛋白含量及比活

由表6的活性测定结果可知，在pH 5.2条件下平衡Q Sepharose Fast Flow强阴离子交换层析柱，AAT需要用含100mM NaCl的缓冲液才能洗脱下来，本发明用含65mM NaCl的缓冲液就能洗脱下来，比较例2用的洗脱液中含盐量比本发明高得多，且得到的AAT洗脱样品中虽然蛋白活性、含量及比活均高于本发明，但SDS-PAGE显示洗脱下来的蛋白中杂带多，即杂蛋白含量高，AAT纯度低。

由SDS-PAGE分析结果(见图11)可知，含25mM NaCl的平衡液洗脱去除转铁蛋白和白蛋白，含50mM NaCl的平衡液洗脱去除白蛋白和维生素D结合蛋白，含100mM NaCl的平衡液在洗脱AAT的同时也洗脱下部分大分子(分子量＞180kDa)杂蛋白，且转铁蛋白的残留较多，纯化效果不如本发明中先进行低pH值(pH 4.6-pH 4.8)洗脱杂蛋白，再增加盐浓度(45-65mM NaCl)洗脱AAT(图5)。

比较例3

a)Cohn组分Ⅳ沉淀溶解、浓缩：同实施例1。

b)、PEG沉淀：同实施例1。

一次病毒灭活：无。

c)、一次超滤浓缩：同实施例1。

d)、阴离子交换层析精制：阴离子交换层析纯化，Q Sepharose Fast Flow强阴离子交换层析柱(柱体积30ml)用pH 5.3 20mM醋酸盐缓冲液作为平衡液平衡8-10个柱体积，然后上样超滤液，之后先用平衡液冲洗未结合在柱上的转铁蛋白和白蛋白，再用pH 4.720mM醋酸盐缓冲液洗脱结合在柱上的白蛋白和维生素D结合蛋白，最后用含55mM NaCl的pH5.3 20mM醋酸盐缓冲液洗脱结合在柱上的AAT，得到AAT洗脱样品，整个纯化过程的流速为150cm/h。

e)、二次超滤浓缩：AAT洗脱样品用pH 6.5 20mM磷酸盐缓冲液超滤5-10个体积，得到二次超滤液，超滤膜的截留分子量为30kDa。

f)、蓝色染料亲和层析精制：蓝色染料亲和层析纯化，Blue Sepharose 6FastFlow蓝色染料亲和层析柱(柱体积20ml)用pH 6.5 20mM磷酸盐缓冲液平衡8-10个柱体积，然后上样二次超滤液，之后用平衡液冲洗未结合在柱上的AAT，得到AAT穿透样品，整个纯化过程的流速为40cm/h；最后用含0.5M KSCN的pH 6.5 20mM磷酸盐缓冲液洗脱结合在柱上的白蛋白后，该层析柱可重复利用。

g)、二次蓝色染料亲和层析精制：无。

h)、冻干：无。

i)、二次病毒灭活：无。

以胰蛋白酶为AAT抑制的靶酶，采用发色底物法测定终产品的活性，BCA法测定蛋白含量，计算比活，比较例3各步骤中所得样品的指标见表7。

表7各步骤得到样品中的AAT活性、蛋白含量及比活

由表7的活性测定结果可知，在pH6.5条件下平衡Blue Sepharose 6Fast Flow蓝色染料亲和层析柱，AAT不与蓝色染料结合，保留在穿透样品中，该穿透样品的比活为1329.65U/mg，低于采用pH 5.0-5.4条件下平衡亲和层析柱得到的AAT穿透样品的比活。

由SDS-PAGE分析结果(见图12)可知，pH6.5平衡条件下，AAT穿透样品中含有大量维生素D结合蛋白，含0.5M KSCN的pH 6.5 20mM磷酸盐缓冲液洗脱样品中只有白蛋白和少量转铁蛋白，说明在pH 6.5平衡条件下，蓝色染料更多地结合白蛋白，而对其他蛋白的结合较少。在本发明pH 5.0-5.4平衡条件下，含0.5M KSCN的缓冲液洗脱样品中包含大分子(分子量＞180kDa)杂蛋白、转铁蛋白、白蛋白、维生素D结合蛋白，说明在pH 5.0-5.4平衡条件下蓝色染料不仅结合白蛋白，还结合其他蛋白(图6)。因此，本发明中采用的亲和条件有利于将AAT与其他杂蛋白分离。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。