Cohn FIV中α1-抗胰蛋白酶的纯化与鉴定

摘要

α1-胰蛋白酶(α1-antitrypsin，α1-AT)是人类血浆中最丰富的蛋白酶抑制物，主要是由肝细胞合成的一种糖蛋白，在单核巨噬细胞、肠上皮细胞、肾实质等肝外组织及某些肿瘤细胞中也能产生，它能抑制多种蛋白酶及多种丝氨酸内切肽酶。1989年，人血浆α1-AT制剂获得美国FDA批准用于严重α1-AT缺乏的患者的替代治疗。随着基因工程技术的发展，重组人血浆α1-AT获得成功表达，但目前尚无重组表达的产品被批准上市。 目前经FDA批准应用于α1-AT缺乏疾病替代治疗的α1-AT制剂仍供不应求，国内尚无同类产品问世，且生产血液制剂要产生大量的CohnFIV废弃组分，因此开发新血液制剂α1-AT无论在血浆综合利用理论研究及实际应用方面均具有重要意义。 本文以CohnFIV为原料，加热处理后，经五种不同的层析纯化工艺路线分离纯化α1-抗胰蛋白酶，其中DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换层析结合SP-SepharoseHighPerformance阳离子交换层析和ConASepharose4B亲和层析结合DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换层析两种纯化工艺纯化的α1-AT纯度分别达到97％和93％。对ConASepharose4B亲和层析结合DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换层析纯化α1-AT的工艺进行初步放大，纯化的α1-AT纯度仍可达92％。纯化的α1-AT表观分子量为56KD。用免疫双扩散试验、免疫印迹分析对其进行鉴定，证明其具有良好的免疫反应性及较高的纯度。以胰蛋白酶抑制能力试验测其生物活性，DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换层析结合SP-SepharoseHighPerformance阳离子交换层析纯化的αl-AT比活性为0.699PU/mg，活性回收率为29.39％；ConASepharose4B亲和层析结合DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换层析纯化的α1-AT比活性为0.866PU/mg，活性回收率为56.59％；前一种层析纯化工艺路线初步放大试验所获α1-AT比活性为0.762PU/mg，活性回收率为56.40％。采用巴氏法(液态，60℃10小时加热)和S/D处理法(0.3％/1％，24℃水浴6小时)灭活病毒，灭活后活性回收率分别达到98.0％和98.7％。本实验研究初步建立了从CohnFIV中分离α1-AT的分离纯化工艺，为大规模纯化α1-AT奠定实验室基础。

目录

文摘

英文文摘

前言

主要设计试验技术路线

第一部分α1-抗胰蛋白酶的分离纯化工艺研究

实验材料

实验方法

实验结果

第二部分α1-抗胰蛋白酶检测方法的初步研究

实验材料

实验方法

实验结果

第三部分病毒灭活方法初探

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

论文总结

参考文献

综述：α1-抗胰蛋白酶的研究进展

致谢