利拉鲁肽对晚期糖基化终末产物诱导的人牙周膜细胞的影响

摘要

目的：
　　本实验通过检测利拉鲁肽（Liraglutide，Lira）对晚期糖基化终末产物（Advanced glycosylation end products，AGEs）诱导的人牙周膜细胞（periodontal ligament cells，PDLCs）增殖、凋亡、受体表达、成骨分化及炎症因子表达的作用，探讨hPDLCs在AGEs积累时，Lira对hPDLCs的保护及修复作用。
　　方法：
　　采用酶消化法联合组织块培养法分离培养原代hPDLCs，取3-6代细胞用于后续实验，采用细胞化学染色及成骨诱导21天茜素红染色法进行hPDLCs鉴定。采用MTT法筛选Lira对AGEs诱导的hPDLCs的最佳作用浓度及作用时间。采用MTT法检测Lira对AGEs诱导的hPDLCs增殖活性的影响。采用Hoechst33258荧光染色法及Annexin-V-FITC/PI双染检测凋亡水平。采用Real-time PCR及Western Blot检测晚期糖基化终末产物受体RAGE及胰高血糖素样肽受体GLP-1R的表达水平、成骨因子Runx2和ALP的表达水平、炎症因子TNF-α和IL-6的表达水平。采用茜素红染色法检测矿化结节形成水平。
　　结果：
　　1.细胞化学染色：HE染色细胞呈纤维细胞样长梭形外观；抗波形丝蛋白染色阳性，抗角蛋白染色阴性，证明细胞来源为中胚层；茜素红染色见矿化结节形成证明细胞具有成骨分化能力。综上可鉴定细胞为人牙周膜细胞；
　　2.MTT结果：AGEs对hPDLCs细胞增殖抑制作用的最佳作用浓度是100μg/mL，最佳作用时间是48h；Lira对AGEs诱导的hPDLCs的最佳作用浓度是100nmol/mL，最佳作用时间是24h；与对照组相比，AGEs组的增殖抑制率显著增高（P﹤0.01），Lira组的增殖抑制率显著降低（P﹤0.01），AGEs+Lira组的增殖抑制率显著高于Lira组（P﹤0.01），但低于对照组。
　　3.Western Blot及Real-time PCR结果：（1）受体表达：hPDLCs上RAGE蛋白及mRNA及GLP-1R蛋白及mRNA的表达。相比对照组，AGEs组显著促进RAGE的表达（P﹤0.01），抑制GLP-1R的表达（P﹤0.05）；Lira组抑制RAGE的表达（P﹤0.05），促进GLP-1R的表达（P﹤0.05），与AGEs组相比，AGEs+Lira组抑制RAGE的表达（P﹤0.05），促进了GLP-1R的表达（P﹤0.05）；（2）成骨因子：相比对照组，AGEs组抑制Runx2和ALP蛋白及mRNA的表达（P﹤0.01， P﹤0.05），Lira组促进Runx2和ALP的表达（P﹤0.05，P﹤0.01），与AGEs组相比，AGEs+Lira组促进Runx2和ALP的表达（P﹤0.05，P﹤0.01）；（3）炎症因子：相比对照组，AGEs组促进IL-6及TNF-α蛋白及mRNA的表达（P﹤0.01），Lira组抑制IL-6及TNF-α的表达（P﹤0.05，P﹤0.01），与AGEs组相比，AGEs+Lira组抑制IL-6及TNF-α的表达（P﹤0.01）；
　　5.Hoechst33258染色Annexin-V-FITC/PI细胞流式术结果：对照组和Lira组的细胞核均未发生改变；AGEs组细胞核发生皱缩，染色质浓缩或断裂；AGEs+Lira组细胞发生核皱缩，染色质浓缩或断裂的细胞减少。相比对照组，AGEs组的凋亡率显著增高（P﹤0.01）；Lira组降低（P﹤0.01）；相比AGEs组，AGEs+Lira组的凋亡率显著降低（P﹤0.01），但高于对照组；
　　7.茜素红染色结果：AGEs组的紫红色矿化结节明显少于对照组，AGEs+Lira组的紫红色矿化结节明显多于AGEs组。经Image J软件对染色进行分析，Lira组与对照组，对照组与AGEs组，AGEs+Lira组与AGEs组之间均表现出明显差异（P﹤0.05，P﹤0.01，P﹤0.01）。
　　结论：
　　1.Lira对AGEs诱导的hPDLCs的最佳作用浓度是100nmol/mL，最佳作用时间是24小时。
　　2.hPDLCs上具有RAGE及GLP-1R受体的表达。Lira可促进正常hPDLCs及AGEs诱导的hPDLCs上GLP-1R的表达，抑制RAGE的表达；
　　3.Lira可促进正常hPDLCs和AGEs诱导的hPDLCs增殖，抑制其凋亡，促进成骨分化，抑制炎症因子的表达。为糖尿病牙周病患者选择Lira保护及修复牙周组织提供实验依据。

目录

声明

英文缩略表

第一章 引言

1.1糖尿病与牙周病之间的关系

1.2利拉鲁肽

1.3选题依据及思路

第二章 利拉鲁肽对晚期糖基化终末产物诱导的人牙周膜细胞增殖活性的影响

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3实验结果

2.4讨论

第三章 利拉鲁肽对晚期糖基化终末产物诱导的人牙周膜细胞凋亡及受体的影响

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3实验结果

3.4讨论

第四章 利拉鲁肽对晚期糖基化终末产物诱导的人牙周膜细胞成骨分化和炎症因子表达的影响

4.1实验材料

4.2实验方法

4.3实验结果

4.3讨论

全文总结

参考文献

在学期间的研究成果

致谢

临床病例