与母系遗传性非综合症耳聋相关的线粒体tRNAPhe593T>C突变的分子致聋机制研究

摘要

耳聋是一项世界范围内的重大公共卫生问题,全球约有3.6亿耳聋人口。线粒体tRNA基因的突变是母系遗传性耳聋的致病因素之一。我们发现了一个携带线粒体tRNAPhe593T>C(m.593T>C)突变的东乡族母系遗传性非综合症性耳聋家系。该突变位于tRNAPhe的DHU环上。本论文分别从永生化淋巴细胞系和融合细胞系探讨了线粒体tRNAPhe593T>C突变的的分子致病机制。
　　实验中首先构建永生化淋巴细胞系，对其进行初步的线粒体氧化呼吸功能的检测。实验中观察到携带线粒体mt593T〉C突变的细胞系稳态tRNAPhe的表达水平相比对照细胞系下降44％（P=0.0309）。线粒体DNA编码的多肽：P.MT-ND4、p.MT-ND5和 p.MT-ND6,p.MT-Cytb,P.MT-C03的合成水平分别是对照组细胞的32%，74%，79%,69%,34%。突变细胞系的基础氧耗，ATP相关氧耗，最大氧耗较对照细胞系下降，基础OCR，ATP-link OCR和最大OCR的水平只有对照组细胞的54%，37%，57%差异显著。氧化呼吸链的复合物III的酶活性降低，线粒体合成ATP的水平相比较对照细胞系下降了39％。
　　在明确线粒体DNA593T〉C突变会造成线粒体的氧化呼吸链功能障碍后，提取线粒体，建立了核背景一致的转线粒体融合细胞系，进一步分析线粒体 DNA593T〉C突变对线粒体功能的影响，及线粒体中ROS和线粒体膜电位的变化。融合细胞系稳态tRNAPhe的表达水平相比照细胞株下降了的20%（P=0.0168）。线粒体DNA编码的多肽的合成水平随之也出现了下降：P.MT-ND2、p.MT-ND5、P．MT-ATP6、p.MT-Cytb和P.MT-C03的合成水平较对照组都有不同程度的下降。融合细胞系线粒体 ATP合成水平较对照组下降约40%(p=0.0482)，线粒体呼吸链复合物I和复合物III的酶活性降低，线粒体内的ROS生成增多约30%（p=0.0229）,线粒体的膜电位下降18%（p=0.024）。
　　这些结果均表明 tRNAPhe突变会引起线粒体的功能减退，和耳聋的发病相关。在线粒体tRNA593T〉C的发病机制中，可能存在转录后的调控，来放大593T〉C的突变效益，还需要进一步深入的研究。

目录

声明

第一章 前 言

1.1 耳聋概述

1.2线粒体与耳聋

第二章 研究方法与内容

2.1 研究对象

2.2研究内容

2.3实验材料

2.4 细胞系的构建

2.5 DNA相关的实验和方法

2.6 RNA的提取和相关试验

2.7 线粒体的提取及相关实验

2.8蛋白质相关实验和方法

2.9细胞的相关实验

第三章 结果

3.1 永生化淋巴细胞系的构建及淋巴系细胞线粒体的功能检测

3.2 融合细胞系的构建及融合细胞系线粒体的呼吸功能检测

3.3 讨论

缩略词

参考文献

在学期间的研究成果

致谢