南极假丝酵母脂肪酶B高效表达及在选择性酰化方面的应用研究

摘要

南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarctic lipase B， CALB）来源于南极假丝酵母，是一种优良的脂肪酶，它对水溶性、非水溶性物质都有很强的催化活性，在有机合成、手性化合物拆分、医药中间体等领域得到广泛应用。然而南极假丝酵母产酶量低，发酵周期长，远不能满足目前的需求。而通过基因改良的米曲霉发酵获得的CALB，其售价约为16000元/千克，不适合工业化应用。
　　 本课题主要目的是以毕赤酵母（Pichia pastoris）作为表达系统，通过基因工程手段提高CALB的表达量，从而降低其工业应用的成本。主要研究内容及其结果如下：
　　 首先，探索野生型CALB基因在毕赤酵母表达的可行性。以南极假丝酵母基因组为模板扩增CALB基因的前导肽（pro-peptide）和编码成熟肽(mat-peptide)部分，将PCR扩增产物插入pPIC9K的多克隆位点，得到重组质粒pPIC9K-CALB，将其线性化后转化毕赤酵母GS115，最终获得8拷贝数的重组毕赤酵母GS115-pPIC9K-CALB。对GS115-pPIC9K-CALB进行甲醇诱导，收集不同诱导时间的上清液进行酶活测定和SDS-PAGE分析，结果表明毕赤酵母无法表达野生型CALB。
　　 其次，鉴于野生型CALB基因无法在毕赤酵母系统实现表达，根据CALB的氨基酸序列（GenBank accession No. Z30645.1），采用巴斯德毕赤酵母偏好密码子重新设计CALB基因序列，序列保留pro-peptide和mat-peptide部分，并在序列的下游添加His-Tag标签序列，合成优化序列。将序列插入pPIC9K的多克隆位点得到重组质粒pPIC9K-syCALB，转化毕赤酵母GS115后得到重组毕赤酵母GS115-pPIC9K-syCALB。经过1％甲醇诱导120h，酶活力达到最大值46U mL-1，蛋白表达量为242.2mg L-1。SDS-PAGE分析表明重组CALB分子量为35kd和38kd，比野生型CALB略大。通过金属螯合层析对发酵上清液纯化，将目的蛋白纯化了5.23倍，比活达到856.7U mg-1，酶活的回收率达到81.2%。对重组CALB进行酶学性质研究发现，其最适反应温度和pH分别为30℃和6.5，CALB在pH为5.0-8.0之间、40℃以下有较好稳定性，Ca2+，2n2+，Mn2+有助于酶活的提高，而Cu2+，Ag+，Fe3+强烈抑制酶催化反应。摇瓶优化阶段，确定最优诱导培养基为BMMY，培养基最适pH为6.0，最佳诱导温度为20℃，甲醇最适添加量为2%。使用3.6L发酵罐高密度培养重组毕赤酵母GS115-pPIC9K-syCALB，采用变温发酵策略，以BSM作为培养基。前期流加甘油充当碳源，30℃培养；当细胞干重为25.7g L-1时进行甲醇诱导，诱导温度为20℃，甲醇起始流加速率为1.8mLh-1 L-1，根据溶氧变化手动控制甲醇流加速率，维持溶氧值为25%。诱导112h后酶活为163.7U mL-1，蛋白浓度在诱导124h达到最大值，为824.7mg L-1。
　　 最后，在毕赤酵母高效表达CALB的基础上，尝试以聚丙烯树脂(PP)固定化CALB，并以PP-CALB催化维生素A前体的单酰化反应。以商品化CALB，即Novozyme435优化得到最佳反应条件：溶剂为正己烷（分子筛干燥除水），酰基供体为乙酸乙烯酯，其与维生素A前体的摩尔比控制在3∶1，酶添加量为5mg mL-1，反应温度50℃，反应时间90min。Novozyme435和PP-CALB对氢化物转化率分别为88.7%和39%，产物均为单酰化物。