重组人组织激肽释放酶结合蛋白对隐形眼镜护理液所致细胞损伤的修复研究

摘要

近年来，许多文献报道多功能型隐形眼镜护理液能引起眼角膜损伤。据报道，多功能型护理液能引起人角膜上皮细胞（HCE）氧化应激反应、炎症反应，造成细胞凋亡，并且多功能型护理液是通过激活NF-κB信号通路来诱发细胞炎症反应。动物实验也表明多功能型护理液引起明显的兔角膜组织损伤并降低角膜对细菌的抵抗力。
　　人组织激肽释放酶结合蛋白(Kal，Kallistatin)是一种功能多效的蛋白，也是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，能参与多条细胞通路的调控，具有促进血管修复和降低高血压、炎症、氧化应激、细胞凋亡等作用，能抑制NF-κB信号通路达到抗炎的作用。与Kal同一家族的SERPINA3K对HCE细胞具有抗炎，抗血管生成和抗氧化活性。基于Kal的功能多效性与SERPINA3K对角膜上皮细胞的生物活性，我们推测Kal可能对HCE损伤有较好的修复作用。
　　主要研究内容：
　　（1）制备Kal蛋白：通过筛选实验室构建保存的重组人Kal(rhKal)的酵母菌株，得到高表达的菌株，利用发酵罐技术进行诱导表达，进一步分离、纯化rhKal蛋白，经SDS-PAGE检测与ELISA定量，得到的rhKal是高纯度高浓度的。
　　（2）市售五种隐形眼镜护理液（含除过氧化氢外的杀菌成分）对HCE细胞毒性验证：使用CCK-8方法，处理时间为3h，筛选出能使HCE细胞活力显著下降的护理液含量，再观察该含量下细胞形态、检测细胞超氧化阴离子水平及细胞凋亡水平。
　　（3）rhKal对护理液所致HCE损伤的修复作用：将rhKal蛋白应用于五种护理液细胞损伤模型中，对其抗氧化、抗凋亡生物活性进行研究。
　　（4）rhKal对H2O2所致HCE及人结膜上皮细胞（HConEpiC）损伤的修复作用：用H2O2对HCE和HConEpiC处理3h构建损伤模型，考察rhKal蛋白对其损伤修复的影响。
　　结果显示：rhKal对五种隐形眼镜护理液造成的 HCE细胞损伤有显著修复作用，能减少细胞内超氧阴离子，抑制护理液引起的细胞凋亡，具有一定的剂量依赖性。rhKal对H2O2引起HCE和HConEpiC细胞损伤也具有显著修复作用，能有效的抑制细胞凋亡。本研究说明rhKal对隐形眼镜护理液引起的细胞损伤均具有修复作用，为研制一种针对隐形眼镜护理液损伤的滴眼修复液奠定了基础。

目录

声明

主要符号对照表

第1章 引言

1.1 隐形眼镜、隐形眼镜护理液及角膜

1.2 隐形眼镜护理液对眼睛的损伤

1.3 组织激肽释放酶结合蛋白

1.4 Kal与隐形眼镜护理液损伤的联系

1.5 研究方法

第2章 rhKal高表达菌株的筛选及rhKal制备

2.1 实验材料、仪器及其常用溶液配制

2.2 实验方法

2.3 实验结果与分析

2.4 本章小结

第3章 隐形眼镜护理液对人角膜上皮细胞的损伤作用

3.1 实验材料、仪器及常用溶液配制

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

第4章 rhKal对隐形眼镜护理液引起HCE损伤的修复作用

4.1 实验材料、仪器及常用溶液配制

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

第5章 rhKal对过氧化氢引起人角膜、结膜上皮细胞损伤的修复作用

5.1 实验材料、仪器及常用溶液配制

5.2 实验方法

5.3 实验结果

5.4 讨论

第6章 总结与展望

6.1 总结

6.2 创新点

6.3 展望

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果