核心结合因子αl(Cbfα1)在高磷诱导VSMC钙化中信号通路的研究

摘要

目的：本文旨在探讨核心结合因子αl（Cbfα1）在高磷诱导的血管平滑肌细胞（VSMC）钙化中可能的信号通路，观察丝/苏氨酸蛋白激(Akt)在VSMC钙化中的表达情况及其与Cbfα1表达的关联性，试图阐明AKt在高磷诱导血管平滑肌细胞钙化中的作用。
　　方法：1.体外原代培养SD大鼠VSMC,倒置相差显微镜观察细胞形态及生长状态。α-SMA免疫组化鉴定细胞；3-5代细胞用于后续实验。
　　2.将细胞随机分为两组：（1）正常磷组（1.3mmol/L）；(2)高磷组(2.6mmol/L)，干预7天后，观察细胞形态学变化及茜素红染色检测细胞钙盐沉积情况；Real-time PCR检测Cbfα1、骨桥蛋白（OPN）mRNA表达情况；Western Blot技术检测p-AKt(ser473)、Cbfα1、OPN蛋白表达情况。
　　3．检测到高磷组AKt活化表达后，给与AKt抑制剂Wortmannin干预。VSMC分为：（1）高磷组（2.6mmol/L）；（2）高磷+Wortmannin(5nmol/L)；（3）高磷+Wortmannin（10nmol/L）（4）高磷+ Wortmannin（30nmol/L）；（5）高磷+ Wortmannin（50nmol/L）；(6)高磷+ Wortmannin（100nmol/L），干预24h后，Real-time PCR检测Cbfα1、骨桥蛋白（OPN）mRNA表达情况; Western Blot检测p-AKt(ser473)、Cbfα1、OPN蛋白表达情况。所有实验重复3次。
　　结果：1.细胞鉴定：倒置相差显微镜观察，大鼠VSMC呈梭行，典型“峰-谷”样生长；抗α-SMA免疫组织化学显示，VSMC胞浆呈现大量棕色颗粒。
　　2．干预7天后，茜素红染色显示，正常磷组无钙盐沉积，而高磷组钙盐沉积明显；Real-time PCR显示,与正常磷组相比，高磷组Cbfα1、OPN mRNA表达增高（P<0.05）；Western Blot显示，与正常磷组相比，高磷组p-AKt(ser473)、Cbfα1、OPN蛋白表达增高（P<0.05）。
　　3.给与Wortmannin干预24h后，茜素红染色结果，与高磷组相比，高磷+Wortmannin（5nmol/L）和（10nmol/L）组钙盐沉积无明显减轻，高磷+Wortmannin（30nmol/L）一定程度减轻，而高磷+ Wortmannin（50nmol/L）和（100nmol/L）组明显减轻；Real-time PCR显示，相对于高磷组，高磷+Wortmannin（5nmol/L）和（10nmol/L）组Cbfα1、OPN mRNA表达无明显差异（P>0.05）,高磷+ Wortmannin（30nmol/L）组表达量一定程度减弱（P<0.05）,高磷+ Wortmannin（50nmol/L）和（100nmol/L）组表达明显减弱（P<0.05）。Western Blot显示，与高磷组比较，高磷+ Wortmannin（5nmol/L）与（10nmol/L）组 p-AKt(ser473)、Cbfα1、OPN蛋白表达变化不明显（P>0.05），高磷+Wortmannin（30nmol/L）组表达相对减弱（P<0.05）,高磷+ Wortmannin（50nmol/L）与（100nmol/L）组表达明显减弱（P<0.05）。
　　结论：1.高磷可体外诱导大鼠VSMC钙化，Cbfα1、OPN mRNA表达增高；p-AKt(ser473)、Cbfα1和OPN蛋白表达增高。
　　2.Wortmannin可明显抑制高磷诱导的大鼠VSMC钙化，抑制其增高的Cbfα1、OPN mRNA的表达及增高的p-AKt(ser473)、Cbfα1和OPN蛋白的表达。
　　3.AKt参与调控高磷诱导的大鼠VSMC钙化，且可能通过调控Cbfα1因子而起作用。

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中文摘要

英文摘要

前言

第一部分A K t在高磷诱导VSM C钙化中的表达

材料与方法

1.材料

2 实验方法

3. 统计学处理

实验结果

1. 大鼠血管平滑肌细胞培养及鉴定

2. 细胞形态学变化

3. 茜素红染色结果

4.Real-time PCR检测Cbfα1、OPN的mRNA表达

4.Western Blot检测p-AKt(ser473)、Cbfα1、OPN蛋白表达

第二部分Wortmannin抑制AKt对高磷诱导的VSMC钙化的影响

1. 细胞形态学变化

2.茜素红染色

3.Real-time PCR检测Cbfα1、OPN的mRNA表达

4.Western-Blot检测p-AKt(ser473)、Cbfα1、OPN的蛋白量表达

讨论

1.高磷诱导VSMC钙化以及Cbfα1，OPN mRNA和蛋白高表达

2. 在高磷诱导的 VSMC 钙化模型中，AKt 可能通过调控 Cbfα1 表达诱导调节VSMC钙化的发生。

全文结论

参考文献

致谢

慢性肾脏病血管钙化可能信号通路的研究进展

参考文献