核心结合因子α1 siRNA靶向抑制对高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的影响

摘要

【目的】
　　本课题利用小分子干扰RNA(siRNA)靶向抑制血管平滑肌细胞(VSMC)中Cbfα-1基因表达,观察Cbfα-1表达抑制对高磷诱导的VSMC成骨样转分化及钙盐沉积的影响,从而探讨Cbfα-1在高磷诱导的VSMC钙化中的作用,试图进一步阐明CKD血管钙化的可能机制,并为治疗提供可能的靶点。
　　【方法】
　　1.组织块贴壁法原代培养VSMC,倒置相差显微镜观察细胞形态及α-SMA免疫组化鉴定;3~8代VSMC用于实验。
　　2.针对大鼠Cbfα-1基因设计合成4对候选siRNA序列,以阳离子脂质体为载体,转染体外培养的VSMC细胞;FAM荧光标记siRNA测定转染效率并优化转染条件。RT-PCR法分析4对候选siRNA序列对Cbfα-1基因表达的抑制作用,筛选出有效siRNA序列。
　　3.将筛选出的有效siRNA序列转染VSMC,细胞分为4组:(1)正常磷(1.3mmol/L)组;(2)高磷(2.6mmol/L)组;(3)siRNA转染组:高磷(2.6mmol/L)+转染试剂+Cbfα-1-siRNA(有效siRNA序列);(4)阴性转染对照组:高磷(2.6mmol/L)+转染试剂+阴性对照siRNA,转染后24h、48h通过RT-PCR技术检测成骨样转分化相关基因Cbfα-1、骨桥蛋白(OPN)mRNA表达情况;转染后48、72h采用WesternBlot方法检测Cbfα-1、OPN蛋白表达情况;转染后第6天通过茜素红染色法检测细胞钙盐沉积情况。所有实验至少重复3次。
　　【结果】
　　1.细胞鉴定:双目倒置相差显微镜下,大鼠VSMC为梭形细胞,呈典型的“峰-谷”样生长。抗α-SMA抗体免疫组织化学染色显示,VSMC胞浆内见大量棕色颗粒。
　　2.荧光显微镜下观察显示,在Cbfα-1-siRNA浓度为100nmol/L、Lipo为8μL/孔转染条件下,转染效率约55％;RT-PCR结果显示Cbfα-1siRNA1952序列相对基因抑制水平最强,转染24h以后沉默效率达81.77%,故作为有效siRNA序列。
　　3.RT-PCR结果显示,转染后24h,与正常磷组相比,高磷组VSMC中Cbfα-1及OPNmRNA表达明显增加(P<0.01),与高磷组及阴性转染对照组相比,siRNA转染组Cbfα-1mRNA表达明显降低(P<0.01),而三组间OPNmRNA表达无明显差异(P>0.05);转染后48h,siRNA转染组Cbfα-1mRNA表达仍低于高磷组及阴性转染对照组(P<0.05),但高于正常磷组(P<0.05),OPNmRNA表达低于高磷组及阴性转染对照组(P<0.05),但高于正常磷组(P<0.05)。
　　4.WesternBlot结果显示,转染后48h,与正常磷组相比,高磷组Cbfα-1及OPN蛋白表达明显增加(P<0.01),siRNA转染组Cbfα-1蛋白表达较高磷组及阴性转染对照组明显降低(P<0.01),三组间OPN蛋白表达无明显差异(P>0.05);转染后72h,siRNA转染组Cbfα-1蛋白表达仍低于高磷组及阴性转染对照组(P<0.05),但高于正常磷组(P<0.05),OPN蛋白表达低于高磷组及阴性转染对照组(P<0.05),但高于正常磷组(P<0.05)。
　　5.茜素红染色结果显示,正常磷组细胞无明显钙盐沉积,高磷组和阴性转染对照组细胞钙盐沉积明显,而siRNA转染组细胞钙盐沉积明显减轻。
　　【结论】
　　1.高磷条件可在体外成功诱导大鼠VSMC钙化。化学合成的Cbfα-1siRNA通过脂质体瞬时转染可以有效抑制VSMCCbfα-1基因和蛋白的表达。
　　2.Cbfα-1基因沉默可明显抑制高磷诱导的VSMC向成骨样转分化及细胞钙化;Cbfα-1可望成为CKD血管钙化治疗的靶点。

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英文缩略词表

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分Cbfα-1 siRNA设计、合成与转染目的细胞

引言

材料与方法

一．材料

二．实验方法

三．统计学处理

实验结果

1 大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）原代培养简要流程

2 大鼠VSMC鉴定

3 转染效率测定结果

4 RT-PCR法分析4对Cbfα-1 siRNA序列对Cbfα-1基因表达的抑制作用

讨论

第二部分siRNA抑制Cbfα-1表达对高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的影响

引言

材料与方法

一．实验材料

二．实验方法

三．统计学处理

实验结果

1 RT-PCR检测Cbfα-1、OPN结果

2 Western Blot 检测Cbfα-1、OPN蛋白表达

3 茜素红染色

讨论

全文结论

参考文献

在读期间已（待）发表的论文

致谢

慢性肾脏病患者血管钙化及其诊治