青花菜萝卜硫素累积相关基因MY和SMT的功能分析

摘要

青花菜(Brassica oleracta L.var.italica planch)是发达国家进口量最大的蔬菜之一。不但营养价值高且富硒,更具特色的是其含有迄今为止在蔬菜中发现的预防抑制癌症活性最强的天然活性成分-萝卜硫素(Sulforaphane,SFN)。研究表明,SFN是由黑芥子酶(Myrosinase,MY)水解4-甲基亚磺酰丁基硫苷生成的,在代谢中受硒胁迫含量会急剧降低。硒甲基转移酶(SMT)可将硒转化为非蛋白源含硒氨基酸的形式储存于植株内,并可能参与调控SFN。本研究对MY和SMT基因的功能进行分析,可为SFN的调控研究提供理论依据,并且为定向选育高SFN品种奠定基础。主要结果如下:
　　 (1)利用本实验室从芥蓝中克隆获得的MY基因序列分别构建过量表达载体1301-MY和RNAi表达载体1301-MY RNAi,并以pCAMBIA1301空载体为转化对照,分别转化青花菜；分别获得了64株、49株、47株转基因植株,阳性率分别为90.14％、85.96％、88.68％,根组织GUS染色阳性率分别为81.69％、77.19％、75.47％。Southern blot结果表明,目的片段以单拷贝的形式插入青花菜基因组DNA中。
　　 (2)荧光定量PCR反应表明,MY基因过量表达使转基因植株MY基因的相对表达量比非转基因植株平均提高16.5％；RNAi表达使转基因植株MY基因的相对表达量平均降低23.8％,差异均达到显著水平。过量表达MY基因使转基因青花菜花球SFN含量比未转基因植株增加92.77％；RNA干扰MY基因使转基因青花菜花球SFN含量比未转基因植株降低35.82％。可推断芥蓝MY基因在青花菜中也可参与SFN的合成；
　　 (3)利用本实验室克隆的青花菜SMT基因构建过量表达载体1301-SMT和RNAi表达载体1301-SMT RNAi,并以pCAMBIA1301空载体为转化对照,分别转化青花菜。分别获得阳性植株60株(1301-SMT)、67株(1301-SMT RNAi)、47株(pCAMBIA1301),阳性率分别为88.24％、91.78％、88.68％。根组织GUS染色阳性率分别为82.35％、80.82％、75.47％。Southern blot结果表明,目的片段以单拷贝的形式插入青花菜基因组DNA中。
　　 (4)荧光定量PCR检测表明,SMT基因过量表达使转基因植株SMT基因的相对表达量比非转基因植株平均提高13.93％,差异达显著水平；RNAi使转基因植株SMT基因的相对表达量平均降低15.6％,差异达显著水平。过量表达SMT基因使阳性转基因青花菜花球SFN含量比非转基因植株增加64.12％,RNA干扰SMT基因却未引起花球SFN含量明显变化。硒胁迫处理(5.2 mmol／L Na2SeO4)后,各组转基因植株和非转基因对照植株内SFN含量均降低。其中,过量表达转化植株的SFN含量比处理前减少14.09％,RNA干扰SMT基因表达引起SFN含量的急剧降低(未检测到SFN含量)。可推断SMT基因在青花菜SFN的累积过程中具有重要的调节作用,尤其是在硒胁迫(或在富硒的土壤)环境下可缓解硒胁迫引起的SFN含量降低。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1 萝卜硫素与抗癌防癌作用

1.1 萝卜硫素的结构

1.2 萝卜硫素的合成

1.3 萝卜硫素的抗癌防癌作用

1.4 萝卜硫素的抗癌防癌机制

2 硒与硒的抗癌防癌作用

2.1 硒

2.2 硒的抗癌防癌作用

2.3 硒的抗癌防癌机制

3 萝卜硫素与硒的互作

3.1 植物体内硫与硒竞争效应

3.2 人体内硒与萝卜硫素的协同生理作用

3.3 硒甲基转移酶的发现和利用

4 小结

5 本研究的目的和意义

第二章 萝卜硫素合成相关基因黑芥子酶的功能分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 植物表达载体构建过程重组质粒的验证

2.2 青花菜转基因苗的获得

2.3 转基因青花菜PCR检测

2.4 转基因植物Southern blot检测

2.4 转基因青花菜组织GUS染色

2.6 转基因青花菜荧光定量检测

2.7 转基因植株萝卜硫素含量检测

3 讨论

第三章 萝卜硫素调控相关基因硒甲基转移酶的功能分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 植物表达载体构建过程重组质粒的验证

2.2 转基因青花菜植株的获得

2.3 转基因青花菜PCR检测

2.4 转基因青花菜Southern blot检测

2.5 转基因青花菜组织GUS染色

2.6 转基因青花菜荧光定量检测

2.7 富硒环境下转基因植株萝卜硫素含量分析

3 讨论

第四章 总结与展望

1 总结

1.1 基因功能验证的技术

1.2 MY基因的功能

1.3 SMT基因的功能

2 展望

2.1 MY基因

2.2.SMT基因

参考文献

附录

附录1 主要仪器设备

附录2 MS培养基配方

附录3 部分实验方法

致谢

作者简介