高产洛伐他汀红曲菌的分离鉴定及其红曲发酵条件的优化

摘要

红曲菌，作为一种真菌广泛应用于传统发酵食品中。近年来，由于其活性代谢产物洛伐他汀(Lovastatin)受到广泛关注。红曲作为红曲菌最具代表性的发酵产物，是福建特色自然生物资源。当前，红曲菌存在的如菌种不明确、洛伐他汀产量低等许多问题，限制了福建红曲及其发酵产品的推广和发展。因此，本课题以福建特色产品红曲类产品为研究对象，研究洛伐他汀在固态发酵培养过程中的形成机理并进行适当调控，旨在获得高产洛伐他汀的专用红曲。本文主要研究了如下内容：
　　（1）建立了一个快速高效的测定红曲菌发酵液中洛伐他汀含量的HPLC分析法。色谱条件为Shim-pack5μm，250×4.6mm；检测波长238nm；柱温30℃；流动相为甲醇-水（0.15％磷酸）80-20；流速1.0mL/min。在上述色谱条件下20min内即可检测出样品中洛伐他汀的含量。该检测方法方便、高效、精确，在0.100-300μg/mL范围内线性关系良好，可用于红曲相关产品洛伐他汀的检测。
　　（2）从不同红曲样品中筛选获得24株洛伐他汀产生菌株，对其进行了菌落形态观察和生长特性试验。结果表明：菌丝萌发最适温度28-30℃、最适pH值3.1-4.0；最优生长抑制剂氯霉素。经液态发酵结果显示，N1-2、N5-3和N7-4三株红曲菌洛伐他汀产量最高，分别为9.809mg/L、6.032mg/L和5.723mg/L。
　　（3）采用氯化苄法提取红曲菌总DNA，利用ITS-rDNA序列片段进行扩展和测序，经GenBank数据库中Blastn工具序列比对发现，除N1-2属于Eurotium cristatum外，其它菌株分属于五类红曲菌：Monascus kaoliang、Monascus purpureus、Monascus sp.、Monascus rutilus和Monascus ruber。
　　（4）经Plackett-Burman和Box-Behnken试验设计与优化，结果表明，菌株N7-4发酵生产红曲实验中，对红曲富含洛伐他汀含量影响显著的因子为pH值、柠檬酸三钠和硫酸锌含量，最优参数分别为：5.89、1.02g/100g和1.83mg/100g，经最优发酵条件下，红曲中洛伐他汀含量达2629.53mg/kg。应用Mond方程和Logistic模型，经MATLAB软件构建洛伐他汀生成动力学数学模型为P(t)=0.0389(10.6075exp(0.1988t))/[1-(10.6075/93)(1-exp(0.1988t))]-10.6075)+0.0003?467.8068ln(0.8852+0.1148exp(0.1988t))，经相关性分析表明，动力学曲线与实际试验值拟合良好。

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第一章 引言

1 红曲菌形态

2 ITS鉴定在真菌分类学和系统发育研究中的应用

3 红曲固态发酵技术研究现状

5 本课题研究的主要内容、目的及意义

第二章 洛伐他汀HPLC检测条件的优化

1 材料方法

2 结果与分析

3 结论

第三章 高产洛伐他汀红曲菌的分离纯化

1 材料与方法

2 方法

3 结果与分析

4 结论

第四章 24株洛伐他汀产生菌株的ITS鉴定

1 材料方法

2 试验方法

3 结果与分析

4 总DNA的提取结果

5 结论

第五章 富含洛伐他汀红曲固态发酵条件的优化及洛伐他汀生成动力学的研究

1 材料与方法

1 主要结论

2 主要创新的

3 问题与展望

参考文献

致谢