1.Keap1和p65蛋白相互作用及其作用机制研究;2.Mayven不同截短体原核表达载体的构建、表达和纯化

摘要

本课题前期采用酵母双杂交系统筛选成人肝文库，得到Keap1可能与p65蛋白发生相互作用，因此本课题的主要目的是对Keap1与p65蛋白相互作用的真实性进行验证，并探索其相互作用的分子机制及其生物学意义。 第一章 Keap1与p65蛋白相互作用的验证 目的：验证Keap1与p65蛋白相互作用的真实性。 方法：采用酵母回转、免疫共沉淀、荧光共定位技术分别验证Keap1与p65蛋白在酵母细胞、真核细胞中的相互作用，并初步探讨其相互作用的结构域。 结果：酵母回转验证Keap1与p65蛋白相互作用为阳性结果；免疫共沉淀证实Keap1与p65蛋白在真核细胞中存在相互作用；荧光共定位技术确定静息状态下及TNFα刺激下Keap1与p65能够共定位于细胞质。免疫共沉淀方法发现Keap1与p65的相互作用需要Keap1的全长。 结论：Keap1与p65蛋白在酵母细胞和哺乳动物细胞中均存在特异性相互作用。 第二章 Keap1与p65蛋白相互作用对NF-κB信号通路的影响 目的：探索Keap1与p65蛋白相互作用对NF-κB信号通路的影响。 方法：采用双荧光素酶报告基因系统分析多种条件下，外源性Keap1的转入对p65转录活性的影响，采用免疫印迹方法分析。Keap1对p65蛋白翻译水平的影响。 结果：无论在静息状态下还是在多种应激状态下，Keap1均未能对p65的转录活性和翻译水平产生影响。 结论：未发现Keap1与p65蛋白相互作用对NF-κB信号通路的影响。 第三章 Keap1与p65蛋白相互作用对Keap1-Nrf2-ARE信号通路的影响 目的：探索Keap1与p65蛋白相互作用对Keapl-Nrf2-ARE信号通路的影响。 方法：采用双荧光素酶报告基因系统，探索p65蛋白是否影响Nrf2转录因子的转录活性。 结果：实验发现p65能抑制Nrf2的转录活性，并能增强Keap1对Nrf2转录活性的抑制。在静息或活化状态下，p65、Keap1、以及p65与Keap1的复合物均能抑制Nrf2对NQO1启动子的反式激活作用。结论：Keap1与p65蛋白相互作用能增强Keap1对Nrf2转录活性的抑制。 第四章 p65增强Keap1对Nrf2转录活性抑制的分子机制 目的：探索p65增强Keap1对Nrf2转录活性抑制的分子机制。 方法：采用间接免疫方法，用激光共聚焦显微镜观察p65是否调控Keap1的核转位；采用半定量RT-PCR检测p65是否增强Keap1的转录水平；采用蛋白稳定性实验探索p65是否增强Keap1蛋白的稳定性。 结果：静息状态和TNFα刺激条件下，p65不能调控Keap1的核转位；p65对Keap1的转录水平无显著影响；p65可以增强Keap1的蛋白稳定性。 结论：p65有可能是通过增强Keap1的蛋白稳定性，进而增强Keap1对Nrf2的转录活性的抑制作用。 第二部分 Mayven不同截短体原核表达载体的构建、表达和纯化 目的：拟采用GST-Pull down联合质谱鉴定技术寻找Mayven的相互作用蛋白，探索Mayven蛋白在多发性硬化症中的作用，为多发性硬化症的治疗提供线索。 方法：首先构建Maycen不同截短体的原核表达载体，并探索诱导条件，使之在原核系统中呈可溶性表达，纯化Mayven不同截短体所表达的蛋白。 结果：构建的这些载体测序正确并能够在原核系统中呈可溶性表达，初步纯化了各截短体表达的蛋白。 结论：成功构建了Mayven不同截短体的原核表达载体，并得到了初步纯化的各截短体表达蛋白，为后续寻找MayVen的相互作用蛋白，探索Mayven蛋白在多发性硬化症中的作用提供了线索。

目录

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

摘要

主要仪器设备和常用试剂的配制

第一部分Keap1与p65蛋白相互作用及其作用机制研究

前言

第一章Keap1与p65蛋白相互作用的验证

前言

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

第二章 Keap1与p65相互作用对NF-κB信号通路的影响

前言

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

第三章Keap1与p65相互作用对Keap1-Nrf2-ARE信号通路的影响

前言

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

第四章p65增强Keap1对Nrf2转录活性抑制的分子机制

前言

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

第二部分 Mayven不同截短体原核表达载体的构建、表达和纯化

前言

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

全文总结

文献综述 keap1研究进展

致 谢

攻读博士学位期间发表的论文