盐酸川芎嗪通过mTOR信号通路和凋亡通路抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖

摘要

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，在肿瘤中死亡率居于第六位，全世界每年大约有903，500个新增病例，其中258，400人死亡。近年来，随着诊断技术的提高，筛选程序的有效开展，在包括中国等亚欧国家中，前列腺癌发病率均呈上升趋势。抗雄激素疗法在治疗初期确实起到了一定的效果，但随着治疗的进行，患者在几年内不可避免地对激素治疗发生抵抗，即去势抵抗性前列腺癌。对于这种对内分泌治疗不敏感的激素非依赖性前列腺癌，始终没有较理想的治疗方法，已日益成为临床亟待解决的难题。
　　PI3K/Akt/mTOR信号通路是前列腺癌的一个重要治疗靶点，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR是一种进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，从属于PI3K家族成员，是PI3K/Akt信号通路的下游效应器。mTOR广泛表达于细胞中，调控着不同细胞包括存活、增殖在内的多项细胞功能。其中，mTORC1一方面接受细胞外信号调节着包含5'末端(TOP)mRNAs的翻译，另一方面充当调控帽依赖RNA翻译起始的级联信号通路的中枢。4E-BP1是mTOR下游的关键信号蛋白，也是蛋白质合成中的负向调控因子，它可抑制eIF-4G与eIF-4E的结合，最终抑制蛋白质翻译的起始过程。当4E-BP1被mTOR磷酸化后，从eIF-4E解离下来，eIF-4E去抑制，eIF-4E从而与eIF-4A、eIF-4G结合，形成eIF-4F复合物，并与mRNA帽结合，启动帽依赖性的蛋白质翻译起始。同时，mTORC1还可以磷酸化p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)，从而磷酸化S6蛋白的小核糖体亚基，与其他激酶一起促进蛋白翻译。在前列腺癌和其它多种实体瘤中，mTOR是与肿瘤生成和治疗抵抗均相关的关键蛋白。且在前列腺癌中，mTOR信号通路整合细胞存活相关信号，mTOR及其下游关键蛋白多处于活化状态。
　　和细胞增殖一样，细胞凋亡也是一个受多条信号通路多个基因调控的复杂过程，在受到有害或异常刺激时，细胞通过凋亡进行自我破坏以维持自体稳态，是一种保护性的生物学反应。凋亡通路的失调可能通过促进异常细胞的过度增殖，最终导致癌症的发生，所以凋亡信号通路是肿瘤治疗的一个关键靶点。
　　川芎是一种中药植物，藁本属，伞形科，因其良好的促血液循环作用而颇受关注。川芎最主要的有效成分是川芎嗪(TMP,2，3，5，6-Tetramethylpyrazine)，川芎嗪通过抗血小板聚集和调节微动脉小动脉可以改善微循环，并且川芎还具有抗氧化，抗纤维化，以及钙拈抗等作用。盐酸川芎嗪已经作为一种预防和治疗血管疾病的药物在临床广泛使用多年，且近年来研究显示川芎嗪还有抑制肿瘤生长、多药耐药、迁移等多重抗肿瘤效应。
　　本研究中，我们首先用MTT比色法观察盐酸川芎嗪对前列腺癌PC-3细胞增殖的影响，然后对盐酸川芎嗪抑制前列腺癌PC-3细胞增殖作用的机理进行了探讨:(1)通过Western Blot检测mTOR信号通路关键蛋白mTOR、p70S6K、S6、eIF4E和4E-BP1的磷酸化表达，且通过7-甲基-GTP Pull down继续探讨盐酸川芎嗪对前列腺癌PC-3细胞翻译起始蛋白表达的影响，最后通过LUC荧光素酶证实PC-3细胞蛋白合成率变化;(2)采用流式细胞术和Hochest33342染核观察细胞凋亡情况，以及western blot观察凋亡相关蛋白的表达。这些研究将为盐酸川芎嗪治疗肿瘤提供理论基础和支持。
　　方法：
　　1.0、0.6、1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2、8.4mM的盐酸川芎嗪刺激前列腺癌PC-3细胞48h和72h，刺激人结肠直肠癌细胞HCT-116和前列腺上皮细胞RWPE-148h，MTT检测盐酸川芎嗪对其增殖能力的影响。
　　2.0、4.8、7.2mM的盐酸川芎嗪刺激前列腺癌PC-3细胞48h:
　　(1)检测对mTOR信号通路的影响Western Blot检测 mTOR、p70S6K、S6、eIF4E和4E-BP1蛋白及蛋白磷酸化的表达(磷酸化刺激时间45min)。
　　7-甲基-GTP pulldown检测4EBP1和eIF4E蛋白表达(刺激时间为24h)。
　　LUC荧光素酶检测细胞蛋白合成率变化。
　　RT-PCR检测荧光素酶基因的变化。
　　(2)检测对凋亡的影响流式细胞仪检测细胞凋亡情况.
　　Hochest33342染核后荧光显微镜观察细胞核形态学改变。
　　Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达。
　　3.数据经统计学统计软件(SPSS17.0)处理，组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD检验。
　　结果：
　　1.0、0.6、1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2、8.4mM的盐酸川芎嗪刺激前列腺癌PC-3细胞、人结肠直肠癌HCT-116细胞，和前列腺上皮RWPE-1细胞后，PC-3和HCT-116两种肿瘤细胞增殖明显受抑制(p＜0.05)，且PC-3细胞呈浓度和时间依赖性(p＜0.05)，而RWPE-1增殖无明显影响(p＞0.05，MTT检测)。
　　2.4.8mM和7.2mM的盐酸川芎嗪
　　(1)对mTOR信号通路的影响明显抑制mTOR及其下游关键蛋白(p70S6K、S6、eIF4E、4E-BP1)的磷酸化(p＜0.01)，而这些蛋白本身的表达水平无明显变化(p＞0.05，western blot检测)。
　　明显上调4E-BP1与eIF4E的结合，下调eIF4E的表达(p＜0.05，7-甲基-GTP Pulldown检测)。
　　明显抑制Luciferase报告基因的表达(p＜0.05，LUC荧光素酶检测)，但其Luciferase mRNA水平无明显变化(p＞0.05，RT-PCR检测)。
　　(2)对凋亡的影响促进前列腺癌PC-3细胞的凋亡(p＜0.05，流式细胞术)诱发前列腺癌PC-3细胞核的形态改变（Hochest33342染核，荧光显微镜观察）。
　　上调凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3表达(p＜0.05)，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(p＜0.05，western blot检测)。
　　结论：
　　盐酸川芎嗪对前列腺癌PC-3细胞具有增殖抑制作用，其作用机理分为两个部分:一方面通过促进mTOR及其下游关键蛋白(p70S6K、S6、eIF4E、4E-BP1)的去磷酸化，从而抑制蛋白质翻译起始过程，最终抑制肿瘤细胞增殖;另一方面盐酸川芎嗪通过上调凋亡蛋白Bax和Caspase-3，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达促进细胞凋亡。
　　综上所述，盐酸川芎嗪可以抑制前列腺癌PC-3细胞增殖，促进其凋亡，是一种安全的抗癌中药。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

1．实验材料

1．1 细胞培养

1．2 主要试剂与仪器

2 实验方法

2．1 MTT检测细胞增殖

2．2 Western blotting检测凋亡相关蛋白，mTOR蛋白及其下游关键蛋白及其磷酸化蛋白的表达

2．3 m7GTP琼脂糖珠pulldown检测

2．4 荧光素酶Luo质粒的提取，转染和检测

2．5 细胞总RNA的提取

2．6 qRT-PCR检测Luc mRNA表达

2．7 流式细胞仪检测细胞凋亡

2．8 荧光显微镜观察细胞核变化

2．9 数据统计分析

3 实验结果

3．1 细胞增殖的检测

3．2 Western blotting检测mTOR蛋白和下游关键蛋白及其磷酸化蛋白的表达

3．3 m7GTP琼脂糖珠pulldown检测

3．4 荧光酶Luc的检测

3．5 流式细胞仪检测细胞凋亡

3．6 荧光显微镜观察细胞核变化

3．7 凋亡相关分子的Western Bloting检测

4 讨论

一．盐酸川芎嗪对人激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞增殖的影响

二、盐酸川芎嗪抗前列腺癌PC-3细胞的机制研究

参考文献

全文总结

文献综述 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文