吴茱萸碱对人结肠癌HCT-116细胞体外增殖和迁移的影响及其作用机制的研究

摘要

结肠癌作为一种常见的胃肠道恶性肿瘤，其发病率居全球常见恶性肿瘤的第三位。目前临床上治疗人结肠癌的首选方法为化疗，尽管化疗对癌细胞有直接的杀灭作用，但也会对正常细胞造成一定的损伤作用且易于复发，导致部分病人因承受不了化疗的痛苦而放弃治疗甚至因化疗致死。因而寻找新的低毒高效的抗结肠癌药物迫在眉睫。
　　吴茱萸碱（Evodiamine，EVO）是从吴茱萸干燥果实中提取的生物碱，近年来的研究表明其对多种肿瘤细胞具有明显的抗肿瘤药物活性，但缺乏对人结肠癌HCT-116细胞的作用及相关机制的报道。
　　磷酸葡萄糖异构酶(Glucose Phospho Isomerase，PGI)广泛分布于人体各组织,催化6-磷酸葡萄糖与6-磷酸果糖之间的异构化，是糖酵解和糖生成途径的关键酶。PGI主要在细胞内发挥作用，其在细胞外作为一种自行分泌的细胞因子被称作自分泌运动因子(Autocrine Motility Factor，AMF)。AMF与其自身表面的受体(Autocrine Motility Factor Receptor,AMFR)在多种肿瘤组织中表达上调，尤其在侵袭性或转移性肿瘤（如胃肠道肿瘤和乳腺癌）中更为明显。AMF以自分泌的形式与AMFR结合,通过细胞信号转导引起肿瘤细胞增殖和血管生成，PGI/AMF的下调可以减少肿瘤的生长和转移。
　　MMPs家族蛋白也参与肿瘤的迁移过程。Wen等报道，PGI可诱导MMPs家族中MMP-3基因的转录和翻译。另外也有报道称，磷酸化STAT3可以直接与MMP-3启动子结合从而调节核内MMP-3的合成。由此推断：既然PGI和STAT3都与MMP-3有着密切关系，且MMP-3作为PGI和STAT3共同的下游蛋白存在，因此，我们提出假设：PGI在STAT3和MMP-3所致的肿瘤迁移中起到至关重要的作用？
　　目的:
　　本文以人结肠癌HCT-116细胞株为研究对象，观察吴茱萸碱对细胞增殖和迁移的影响。初次尝试探索EVO对HCT-116细胞中PGI、STAT3和MMP-3的作用，并探讨其可能的作用机制，为临床应用吴茱萸碱治疗结肠癌提供实验依据和线索。
　　方法:
　　体外培养人结肠癌HCT-116细胞株分别加入吴茱萸碱1.5，3.0，6.0，12μmol·L-1继续培养24，48和72h，CCK-8法检测吴茱萸碱对HCT-116细胞生存活性的影响；采用FCM（Flow cytometry）法检测EVO对HCT-116细胞株的凋亡和周期的影响；倒置显微镜镜下观察细胞形态变化；荧光显微镜观察Hochest染色后细胞凋亡的形态学改变；Western Blot检测细胞周期蛋白CyclinA1的表达及凋亡相关蛋白P53，Bax，Bcl-2，Cleved caspae-3的表达；用ELISA法检测不同浓度EVO诱导HCT-116细胞6h后，分泌到胞外上清液中AMF的含量变化；用Transwell法检测EVO和PGI对HCT-116细胞体外迁移的影响；用Western Blot检测6μmol·L-1 EVO诱导HCT-116细胞不同时间后，对细胞中PGI/AMF，JAK2/STAT3信号通路和MMP-3蛋白的影响，并通过设置JAK的特异性抑制剂AG490处理组和EVO处理siPGI(HCT-116)组来探讨PGI/AMF，JAK2/STAT3，MMP-3三者之间的上下游关系。
　　结果:
　　1.CCK-8法结果显示：EVO浓度分别为1.5，3.0，6.0μmol·L-1作用HCT-116细胞24，48和72h后，HCT-116细胞的增殖受到明显抑制（P＜0.05），且呈时间和浓度依赖性。
　　2.FCM法检测细胞周期阻滞：6.0μmol·L-1的EVO诱导HCT-116细胞48h后使细胞周期阻滞在S期和G2/M期，S期的周期比例由对照组的（13.91±6.95）％增加至（39.70±11.74）%；G2/M期的周期比例由对照组的（10.01±1.28）%增加至（41.85±19.76）%（P＜0.05）。
　　3.FCM检测细胞周期凋亡：细胞凋亡率由对照组的（4.25±2.97）%增加至（14.90±5.76）%（P＜0.05）。
　　4.显微镜下观察细胞形态：随着药物浓度的增加，细胞的形态发生改变，胞膜破裂，产生细胞碎片，并出现大量漂浮细胞。
　　5.Hoechst染色结果显示：随着药物浓度的增加，细胞核出现不同程度的核染色质浓缩聚集，核碎裂，并发出较强的蓝白色荧光，表现出细胞凋亡的典型形态学改变。
　　6.WB结果显示：EVO可以显著上调P53，Bax和Cleaved caspase-3的表达；下调Bcl-2，CyclinA1的表达。
　　7.ELISA检测结果显示：EVO作用于HCT-116细胞6h后，培养上清液中的AMF含量随着EVO浓度的增加而减少，但无统计学意义。
　　8.Transwell结果显示：与对照组比较，PGI诱导组使得HCT-116细胞穿膜数增加，EVO和PGI联合用药后使得细胞穿膜数明显减少。
　　9.WB结果显示：EVO可以明显下调HCT-116细胞内PGI，p-STAT3和MMP-3的表达；AG490可以抑制JAK2/STAT3信号通路，同时抑制MMP-3的表达，但对胞内PGI的含量没有明显影响。
　　10.筛选稳定感染细胞株siPGI(HCT-116)，并用EVO进行诱导发现：细胞中PGI下调后，p-STAT3和MMP-3蛋白表达量也明显下调；EVO处理siPGI(HCT-116)细胞株后，细胞中PGI，p-STAT3，MMP-3等蛋白的表达量进一步下调。
　　结论:
　　1．吴茱萸碱可能通过下调细胞周期蛋白CyclinA1的表达，并激活P53信号通路和Caspase-3共同促进HCT-116细胞的凋亡。
　　2．吴茱萸碱对人结肠癌HCT-116细胞的迁移抑制作用可能是通过抑制PGI介导的JAK2/STAT3信号通路的激活，并减少MMP-3的表达来实现的。

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前言

第一部分 吴茱萸碱对人结肠癌HCT-116细胞体外增殖的影响及其作用机制的研究

1材料与方法

1.1 HCT-116细胞株

1.2药品及试剂

1.3主要试剂的配制

1.4主要仪器

1.5细胞培养

1.6细胞增殖实验

1.7 倒置光学显微镜观察细胞形态变化

1.8流式细胞仪检测细胞周期

1.9 Annexin V-FITC/PI 双染法检测细胞凋亡

1.10 Hoechst染色检测细胞核的形态变化

1.11 Western blot检测CyclinA1、P53、Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白的表达

1.12统计学分析

2结果

2.1吴茱萸碱对人结肠癌HCT-116细胞增殖的影响

2.2镜下观察吴茱萸碱对人结肠癌HCT-116细胞生长形态的影响

2.3吴茱萸碱对人结肠癌HCT-116细胞周期的影响

2.4流式仪检测吴茱萸碱对人结肠癌HCT-116细胞凋亡的影响

2.5 Hoechst染色检测吴茱萸碱对人结肠癌HCT-116细胞核的影响

2.6吴茱萸碱对人结肠癌HCT-116细胞周期蛋白CyclinA1、P53信号通路及Cleaved Caspase-3蛋白的影响

3讨论

第一部分图片

第二部分 吴茱萸碱对人结肠癌HCT-116细胞体外迁移的影响及其作用机制的研究

1材料和方法

1.1药品与试剂

1.2实验仪器

1.3 ELISA法检测细胞培养液中PGI/AMF的含量

1.4 Transwell迁移实验

1.5嘌呤霉素实验浓度的筛选

1.6慢病毒质粒的构建和包装

1.7稳定感染慢病毒细胞株(siPGI(HCT-116))的筛选和培养

1.8 EVO对人结肠癌HCT-116细胞中PGI，JAK2/STAT3，MMP-3的影响

1.9 Western blot法检测EVO对siPGI(HCT-116)细胞中PGI，JAK2， p-JAK2，STAT3，P-STAT3，MMP-3等蛋白表达的影响

1.10 AG490对人结肠癌HCT-116细胞中PGI，JAK2/STAT3，MMP-3的影响

1.11 EVO和AG490对人结肠癌HCT-116细胞中PGI，JAK2/STAT3， MMP-3抑制效率的比较

1.12统计学分析

2结果

2.1 ELISA法检测细胞培养液中AMF的含量

2.2人葡萄糖6-磷酸异构酶（PGI）及EVO对HCT-116细胞的体外迁移的影响

2.3嘌呤霉素浓度的筛选结果

2.4稳定感染慢病毒的siPGI(HCT-116) 的筛选及验证

2.5 EVO对人结肠癌HCT-116细胞中PGI，JAK2，P-JAK2，STAT3， P-STAT3的影响

2.6 EVO对siPGI(HCT-116)细胞中PGI，p-STAT3，MMP-3的影响

2.7 AG490对HCT-116细胞中PGI，JAK2，P-JAK2，STAT3，P-STAT3的影响

2.8 EVO和AG490对HCT-116细胞中PGI，JAK2/STAT3，MMP-3等迁移蛋白抑制作用的比较

3讨论

第二部分图片

全文总结

参考文献

文献综述:吴茱萸碱抗肿瘤活性的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文