炎症或非炎症条件下microRNA-101对细胞胆固醇外排影响的分子机制

摘要

目的：探讨在炎症或非炎症条件下microRNA-101(miR-101)对人单核巨噬细胞（THP-1）和人肝癌细胞（HepG2）胆固醇外排的影响，为揭示miR-101在动脉粥样硬化发生中的作用机制提供实验依据。
　　材料与方法:构建miR-101或Anti-miR-101慢病毒载体并建立高表达miR-101或Anti-miR-101细胞模型。使用双荧光素酶报告基因检测验证miR-101与三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1) mRNA的3’非编码区(3'UTR)互补结合，分组为野生型(WT)+Con-miR组、定点突变(SDM)+miR-101组与 WT+miR-101组。非炎症条件下 THP-1与HepG2各分为对照组，miR-101组和Anti-miR-101组；炎症条件下各分为对照组，miR-101组，Anti-miR-101组，IL-6组(0.2％BSA+20ng/ml IL-6)，TNF-α组(0.2%BSA+25ng/ml TNF-α)，IL-6+miR-101/Anti-miR-101组及 TNF-α+Anti-miR-101组。各组再根据是否用 LDL(0.2%BSA+25μg/ml LDL)处理，分为LDL负荷和无LDL负荷。采用oil red O染色检测细胞内脂质蓄积，酶法测定胞内胆固醇含量，荧光标记胆固醇法(BODIPY-cholesterol)检测载脂蛋白 A-I(apoA-I)介导的胆固醇外排。运用实时荧光定量RT-PCR检测miR-101基因表达，Western Blotting检测ABCA1蛋白表达。
　　结果：
　　在结合位点2，与 WT+Con-miR组和 SDM+miR-101组比较， WT+miR-101组ABCA13’ UTR活性显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。非炎症状态，THP-1和HepG2在有无LDL负荷条件下，与对照组相比，miR-101组的ABCA1蛋白表达显著降低，apoA-I介导的细胞胆固醇外排明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。Anti-miR-101组 ABCA1蛋白表达明显增加，apoA-I介导的细胞胆固醇外排显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。miR-101组或 Anti-miR-101组分别可以促进或减少THP-1和HepG2胞内胆固醇聚集，差异有统计学意义(P＜0.05)。在炎症状态下，与对照组比较，IL-6组与TNF-α组HepG2 miR-101表达显著增加，IL-6组THP-1 miR-101表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与IL-6组和TNF-α组比较，IL-6+Anti-miR-101组与TNF-α+Anti-miR-101组THP-1和HepG2 ABCA1蛋白表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：
　　miR-101通过与ABCA1基因3’ UTR端互补结合下调细胞ABCA1蛋白表达抑制胆固醇外排；炎症可以使细胞 miR-101表达增加并增强miR-101促进胆固醇聚集的作用；下调细胞miR-101表达可以减轻炎症对ABCA1蛋白抑制作用。miR-101在动脉粥样硬化的发生发展过程中起到重要作用。

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前言

第一部分 非炎症状态下miR-101对细胞ABCA1蛋白表达、胞内胆固醇含量以及胆固醇外排的影响

实验一 高表达miR-101或Anti-miR-101细胞模型的建立

1 材料与方法

2实验结果

3讨论

实验二 miR-101、Anti-miR-101对THP-1和HepG2 ABCA1蛋白、细胞内胆固醇含量及胆固醇外排的影响

1材料与方法

2 实验结果

3 讨论

第二部分 炎症对细胞miR-101、ABCA1表达的影响

1 材料与方法

1.1实验试剂和材料

1.2主要实验仪器和设备

1.3 实验方法

2 实验结果

2.1 IL-6和miR-101对THP-1内胆固醇含量的影响：

2.2 IL-6和miR-101对HepG2内胆固醇含量的影响：

2.3 IL-6、TNF-α对THP-1miR-101表达的影响：

2.4 IL-6、TNF-α对HepG2miR-101表达的影响:

2.5 IL-6、TNF-α在Anti-miR-101调控下对THP-1ABCA1蛋白表达影响：

2.6 IL-6、TNF-α在Anti-miR-101调控下对HepG2ABCA1蛋白表达影响：

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述: MicroRNAs与脂质代谢

致谢

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