Th细胞发育可塑性的表观遗传机制与疾病表型研究

摘要

本文对Th细胞发育可塑性的表观遗传机制与疾病表型进行了研究。本研究分为三个部分：
　　第一部分：正常小鼠Th优势漂移的发育编程及其DNA甲基化修饰机制。
　　目的：寻找小鼠Th优势漂移的关键基因；观察关键基因表达的漂移轨迹；研究关键基因表达活性漂移的表观遗传机制。
　　方法：CBA法检测不同周龄正常BalBc小鼠血浆中IL-4、IFN-γ水平，荧光定量PCR检测CD4+脾细胞及心肌细胞中Th相关细胞因子、转录因子表达，流式细胞技术检测CD4+脾细胞内IL-4、IFN-γ强度，获得Th优势漂移的正常轨迹；CBA检测腹腔注射5-AZA后血浆IL-4、IFN-γ水平变化；甲基化测序分析不同周龄正常BalBc小鼠CD4+脾细胞及心肌细胞中IL-4、IFN-γ启动子区域DNA甲基化水平；对于胎鼠CD4+脾细胞进行DHS分析，甲基化特异性PCR检测不同周龄正常小鼠CD4+脾细胞DHS位点DNA甲基化，获得Th2调控区域DNA甲基化漂移轨迹；WESTERN BlOT分析不同周龄小鼠CD4+脾细胞DNMTs水平。
　　结果：⑴血浆IL-4浓度随周龄呈下降趋势，1、2、3周龄小鼠血浆IL-4浓度明显高于较大周龄小鼠，自4周起IL-4浓度无明显差异；血浆IFN-γ随周龄呈增加趋势，1、2、3、4周小鼠血浆IFN-γ浓度明显低于较大周龄小鼠，自5周起IFN-γ浓度无明显差异。⑵随周龄增长CD4+脾细胞IL-4mRNA表达呈下降趋势，其中1、2周龄小鼠IL-4mRNA表达明显高于其余各周龄小鼠；随周龄增长IFN-γ RNA表达呈增加趋势，其中1、2、3周龄小鼠IFN-γ mRNA表达明显低于其余各周龄小鼠；各周龄小鼠CD4+脾细胞内IL-5、IL-13、T-bet、STAT1、STAT4、GATA3、STAT6mRNA表达无明显差异。⑶各周龄小鼠CD4+脾细胞内DNMT1、DNMT3bmRNA表达无明显变化趋势；随周龄增长CD4+脾细胞内DNMT3amRNA表达明显增加，至7周龄后无明显差异。⑷小鼠心肌细胞内IL-4、IFN-γ mRNA几乎不表达；各周龄小鼠心肌细胞内DNMT1、DNMT3a、DNMT3bmRNA无明确变化趋势。⑸CD4+脾细胞内IL-4阳性细胞随周龄增长逐渐下降，至7周龄起无明显差异；IFN-γ阳性细胞随周龄增长逐渐增加，至7周龄起无明显差异；⑹1周及3周龄小鼠CD4+脾细胞IL-4启动子区DNA甲基化程度明显低于大周龄小鼠；IFN-γ启动子区随周龄增长甲基化程度逐渐降低；不同周龄小鼠心肌细胞IL-4、IFN-γ启动子区DNA甲基化无明显随周龄变化的趋势；⑺胚胎小鼠CD4+脾细胞Th2相关区域共有10个DHS，分别为:RSH6、RSH7、IL-13P、CNS-1、HSⅠ、HSⅡ、HSⅢ、HSⅣ、HSⅤ、HSⅤA。⑻除1周龄时处于一定程度的去甲基化外，RSH6、HSVa区域在其余各周龄小鼠CD4+脾细胞均处于高度甲基化；IL-13P在各周龄小鼠CD4+脾细胞均处于一定程度去甲基化，无明显周龄变化趋势；HSⅡ在各周龄小鼠CD4+脾细胞均处于完全去甲基化，无明显周龄变化趋势；Ⅲ、HSⅣ区域在各周龄小鼠CD4+脾细胞均处于完全甲基化，无明显周龄变化趋势；RSH7、CNS-1、HSⅠ、HSⅤ区域随周龄增加去甲基化逐渐明显；各周龄小鼠心肌细胞RSH6、RSH7、CNS-1、HSⅢ、HSⅣHSⅤ、HSVa区域均呈高度甲基化状态；IL-13P及HSⅠ区域呈一定程度的去甲基化，无明显周龄变化趋势；HSⅡ区域呈去甲基化状态，无明显周龄变化趋势。⑻腹腔注射5-AZA后，1及2周龄小鼠均死亡，存活小鼠血浆IL-4、IFN-γ呈现出杂乱无章改变。
　　结论：IL-4及IFN-γ是Th漂移的关键基因。Th2组件DNA甲基化的漂移可能是Th表型漂移的物质基础，而CD4+细胞内DNMTs尤其DNMT3a的水平随发育变化可能是Th表型漂移的分子基础。
　　第二部分：哮喘相关因素对Th2调控组件DNA甲基化及Th优势表型的影响。
　　目的：观察RSV感染对于Th表型及Th2调控组件DNA甲基化漂移轨迹的影响，研究RSV感染后滞效应的表观遗传机制。
　　方法：对不同周龄BalBc小鼠进行RSV感染，分别于感染后1周、3周及12周龄时处死，分析CD4+脾细胞内IL-4及IFN-γmRNA表达、Th调控组件DNA甲基化水平，观察RSV感染对于Th优势及DNA甲基化漂移轨迹的影响；对不同周龄BalBc小鼠进行RSV感染，分别于12周、13周时腹腔注射OVA，14周起连续雾化OVA1周，第15周时处死小鼠，分析不同周龄RSV感染对于OVA诱导哮喘小鼠CD4+脾细胞内IL-4及IFN-γmRNA表达、肺部病理的影响；对不同周龄BalBc小鼠进行RSV感染，分别于15周、16周时腹腔注射OVA，17周起连续雾化OVA1周，第18周时处死小鼠，分析不同周龄RSV感染对于OVA诱导哮喘小鼠CD4+脾细胞内IL-4及IFN-γmRNA表达、肺部病理的影响；连续于3周、5周、7周时反复进行RSV感染，分别于15周、16周时腹腔注射OVA，17周起连续雾化OVA1周，第18周时处死小鼠，分析反复RSV感染对于OVA诱导哮喘小鼠CD4+脾细胞内IL-4及IFN-γ mRNA表达、肺部病理、Th调控组件DNA甲基化水平的影响；免疫荧光检测不同周龄小鼠RSV感染后1周CD4+脾细胞DNMT3a、DNMT1、DNMT3b表达。
　　结果：⑴与无感染同龄小鼠相比，不同周龄小鼠在RSV感染1周后血浆IL-4、IFN-γ均增加，肺部炎症反应均明显，CD4+脾细胞内DHS位点均呈去甲基化；⑵3、5、8、9周龄小鼠分别RSV感染3周后，血浆IL-4及IFN-γ浓度、肺部炎症反应与同周龄正常小鼠无差别；3周及5周龄初次感染小鼠3周后PMA刺激下IL-4阳性细胞比例明显高于同龄正常小鼠，CD4+脾细胞RSH7、HSⅠ、CNS-1、HSⅤ4个位点的DNA甲基化较同周龄小鼠低下,而8周、9周龄初次感染小鼠与同龄正常小鼠无差异；⑶与无初次RSV感染的小鼠相比，3周龄、5周龄初次感染小鼠在12周时CD4+脾细胞内RSH7、HSⅠ、CNS-1、HSⅤ4个位点的DNA甲基化低下，OVA诱导后CD4+脾细胞IL-4mRNA表达增高，肺部炎症表现明显；7周、8周、9周龄初次感染小鼠12周时CD4+脾细胞内RSH7、HSⅠ、CNS-1、HSⅤ4个位点的DNA甲基化与正常小鼠无差异，OVA诱导后肺部炎症反应及IL-4表达无明显差异。⑷与无初次RSV感染的小鼠相比，3周龄、5周龄、7周龄、8周龄、9周龄时初次感染小鼠在15周CD4+脾细胞内DHS位点DNA甲基化无明显差异，OVA诱导后CD4+脾细胞IL-4mRNA表达、肺部炎症亦无差异。⑸与正常小鼠相比，于3周、5周、7周龄时连续进行RSV感染小鼠，15周龄时CD4+脾细胞内RSH7、HSⅠ、CNS-1、HSⅤ4个位点的DNA甲基化低下，OVA诱导后 CD4+脾细胞IL-4mRNA表达增高，肺部炎症表现明显。⑹小鼠初次RSV感染后1周CD4+脾细胞DNMT3a、DNMT3b免疫荧光强度较同周龄小鼠无明显差异,DNMT1免疫荧光强度明显减弱。
　　结论：RSV感染可以通过影响CD4+脾细胞DNMT1的表达，使得Th2相关组件DNA甲基化漂移延迟，而后续接触其余不良因素则更易诱导出Th2优势的偏斜。
　　第三部分：哮喘相关因素对Th2调控组件DNA甲基化及Th优势表型影响的分子机制探讨。
　　目的：探讨RSV感染及OVA暴露对Th2调控组件DNA甲基化产生影响的分子机制。
　　方法：比较RSV、紫外线灭活RSV接触小鼠肺部炎症、CD4+脾细胞内IL-4及IFN-γ mRNA水平、Th2调控组件DHS位点DNA甲基化的差异；观察OVA诱导哮喘小鼠肺部及CD4+脾细胞DNMTs、DNA甲基化的情况；研究腹腔注射5-AZA对于OVA诱导哮喘小鼠肺部炎症及CD4+脾细胞内IFN-γ、IL-4mRNA水平影响；检测RSV及OVA诱导后肺部TSLP、IL-33、IL-25mRNA表达。
　　结果：⑴灭活RSV滴鼻（RSV-组）气道炎症较RSV感染小鼠（RSV+组）明显减轻； RSV+组小鼠3周后PMA刺激下IL-4阳性细胞比例较正常小鼠明显增高，RSV-组无明显差异。⑵RSV-组、RSV+组小鼠CD4+脾细胞RSH6、IL-13P、HSⅡ、HSⅢ、HSⅣ、HSⅤA等6个位点的DNA甲基化水平均无差异；RSV感染小鼠在3周后RSH7、HSⅠ、CNS-1、HSⅤ4个位点的DNA甲基化明显低于同周龄小鼠，灭活RSV接触小鼠与同周龄小鼠相比无明显差异。⑶与正常同龄小鼠相比，OVA诱导小鼠CD4+脾细胞及肺部DNMT3a、DNMY3b的表达增高，除HSⅡ外，其余9个Th2相关DHS均为完全的去甲基化，IFN-γ启动子区域甲基化程度增高。⑷RSV感染、OVA诱导小鼠肺部TSLP、IL-33、IL-25mRNA表达均较正常小鼠明显增加。⑸与仅OVA诱导的小鼠相比，腹腔注射5-AZA的OVA诱导小鼠CD4+脾细胞内IL-4mRNA降低，IFN-γ稍增高；5AZA+OVA组小鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞总数、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞比例显著低于OVA组，腹腔注射5-AZA后OVA诱导的气道炎症明显减轻。
　　结论：RSV对于DNA甲基化的影响与其病毒复制、致病性有关；气道上皮来源的Th2类细胞因子并不是影响DNMTs表达的上游因素。

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英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前言

参考文献

第一部分 正常小鼠Th优势漂移的发育编程及其DNA甲基化修饰机制

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4 参考文献

第二部分哮喘相关因素对Th2调控组件DNA甲基化及Th优势表型的影响

1.材料和方法

2.结果

3. 讨论

4. 参考文献

第三部分 哮喘相关因素对Th2调控组件DNA甲基化及Th优势表型影响的分子机制探讨

1.材料和方法

2. 结果

3. 讨论

4. 参考文献

全文总结

附表

文献综述: 表观遗传与哮喘研究进展

致谢

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