叶酸缺乏对小鼠子宫内膜蜕膜化和胚胎发育的影响及其对基因组甲基化模式的调控

摘要

目的：妊娠结局与环境因素密切相关，母体饮食可通过表观遗传调控对胚胎发育及子代的表型产生影响。叶酸作为哺乳动物不可或缺的营养元素，参与DNA合成及甲基化反应等重要生理过程。叶酸缺乏或代谢障碍可改变基因组甲基化模式，影响基因的表达或功能，导致病理过程的发生。以往关于叶酸在妊娠中的作用研究多集中于叶酸代谢酶与胚胎发育的关系，但现有研究成果在深入阐释叶酸缺乏诱发胚胎发育异常的分子机制中仍显不足，关于叶酸在妊娠早期子宫内微环境中的作用报道甚少。课题组前期研究发现母体低叶酸水平并未对子宫内膜容受性造成不良影响，因此，本研究旨在探讨以下问题：1.叶酸缺乏对后续子宫内膜功能即子宫内膜基质细胞的蜕膜化和胚胎发育的影响；2.叶酸缺乏是否会通过改变相关基因的甲基化模式对子宫内膜蜕膜化和胚胎发育产生不利影响？3.平面细胞极性信号通路（planar cell polarity pathway，PCP）作为神经管发育过程的关键信号通路，母体低叶酸水平是否影响其核心基因的表达与功能？本文将分别从母体与胚胎两方面阐明叶酸缺乏对妊娠过程的影响及其对基因组甲基化模式的调控，以全面了解叶酸在妊娠过程中的作用，为调整育龄女性补充叶酸的时机、完善叶酸作用的分子机制提供实验依据。
　　方法：
　　1.动物模型建立及标本收集：采用无叶酸饲料饲养小鼠5周，对照组正常饮食。采用电化学发光法检测小鼠血清叶酸水平，确定叶酸缺乏小鼠模型是否建立成功。
　　正常妊娠模型：将雌鼠与正常性成熟雄鼠合笼交配，以次日查见阴栓记为孕1天（D1）。正常组与叶酸缺乏组小鼠于正常妊娠6到13天（D6-D13）脱颈处死，收集子宫内膜及胚胎组织。
　　人工诱导蜕膜化模型：将雌鼠与结扎输精管的雄鼠合笼交配，以次日查见阴栓记为假孕第1天（PD1），小鼠假孕4天（PD4）一侧宫角注射玉米油诱导蜕膜化，对侧宫角不注射作为对照，正常组与叶酸缺乏组小鼠于PD8处死，收集子宫组织。
　　2.叶酸缺乏效应观察：
　　1）子宫内膜蜕膜化检测：对小鼠蜕膜化时期（D6-D8）子宫外观进行观察，统计蜕膜鼓包数目及直径。借助人工诱导蜕膜化模型进行体内功能实验，通过观察子宫外观、称量子宫湿重、HE染色观察子宫切片形态及Real-time PCR检测蜕膜化标志分子Bmp2、dtPRP的mRNA水平来衡量人工诱导蜕膜化是否成功，统计两组小鼠诱导成功率。体外功能实验通过分离小鼠原代子宫内膜基质细胞，利用雌孕激素诱导蜕膜化实现，采用Real-time PCR检测Bmp2、dtPRP的mRNA表达，利用免疫荧光检测蜕膜化标志分子Desmin的蛋白表达。
　　2）生殖能力及胚胎发育状态检测：对两组小鼠进行饲养繁殖，比较产仔能力。观察 D9-D13小鼠子宫外观和胚胎形态，利用HE染色观察宫腔内胚胎发育状态，统计子宫湿重和胚胎吸收率。
　　3.基因组甲基化模式检测：采用简化代表性亚硫酸氢盐测序法（Reduced Representation Bisulphite Sequencing，RRBS)对正常组和叶酸缺乏组小鼠D6-D8子宫内膜、D9-D11胚胎组织的全基因组甲基化模式进行检测，分析其甲基化差异，统计两组之间存在的差异甲基化区域（Differentially Methylated Regions，DMRs），利用生物信息学方法（GO分析）对差异甲基化基因进行功能聚类。采用Real-time PCR对测序结果中涉及的差异甲基化基因的mRNA水平进行检测。
　　4. PCP信号通路分析：分别采用Real-time PCR、Western blot对两组小鼠 D9-D12胚胎组织中 PCP信号通路核心基因 Vangl（Vangl1和Vangl2）的 mRNA、蛋白水平进行检测。采用免疫共沉淀方法检测正常组和叶酸缺乏组小鼠D9、D10胚胎组织中Vangl基因与其配体Dvl蛋白的相互作用。采用亚硫酸氢盐测序（BSP）法对两组小鼠D9胚胎组织中Vangl1、Vangl2基因启动子区和第一外显子区的甲基化状态进行检测。利用直接测序法对两组小鼠 D9-D13胚胎组织中 Vangl基因（Vangl1和 Vangl2）CDS区进行测序分析，再经比对 NCBI公共数据库，筛选Vangl基因突变或SNP位点。
　　结果：
　　1.叶酸缺乏对子宫内膜蜕膜化的影响：蜕膜化时期子宫外观观察结果显示，与正常组相比，叶酸缺乏组小鼠蜕膜鼓包数目减少、直径较小。人工诱导蜕膜化模型统计结果显示，叶酸缺乏组小鼠成功率仅15％；诱导侧宫角湿重较正常组小鼠减轻；HE染色结果显示正常组小鼠诱导侧可见体积增大、双核或多核的蜕膜细胞，叶酸缺乏组小鼠无类似变化；Real-time PCR结果表明，叶酸缺乏组小鼠诱导蜕膜化后，蜕膜化marker Bmp2、dtPRP的mRNA水平较正常组小鼠显著降低。体外功能实验显示，正常组小鼠基质细胞经激素作用72h后，细胞变大，由长梭形变为多角形，而叶酸缺乏状态下，基质细胞仍呈成纤维细胞样；Real-time PCR结果显示，叶酸缺乏组小鼠基质细胞经激素诱导后Bmp2、dtPRP的mRNA较正常组细胞表达减少；免疫荧光结果显示，蜕膜化marker Desmin蛋白阳性信号在叶酸缺乏组细胞显著减弱。
　　2.叶酸缺乏对胚胎发育的影响：饲养结果表明，叶酸缺乏状态下的小鼠产仔窝数及产仔个数显著减少。叶酸缺乏组小鼠自D10开始出现子宫出血，D11出血加重，D12、D13胚胎吸收明显。与正常组相比，叶酸缺乏组小鼠子宫湿重自D10开始下降，随妊娠进行下降更为明显。叶酸缺乏组小鼠的胚胎吸收率高达70%。正常组小鼠胚胎随妊娠天数增加生长分化呈现可辨认的仔鼠形态，而叶酸缺乏组小鼠胚胎出现生长粘连、分化发育异常。
　　3.叶酸缺乏对基因组甲基化模式的影响：RRBS结果显示，两组小鼠子宫内膜基因组在D6、D7启动子区和CGI区的不同类型mC（包括mCG和mCHG, mCHH，其中H代表A、G或T）分布比例类似， D8叶酸缺乏组小鼠mCG比例增加而mCHH比例下降；胚胎组织基因组在D9、D10启动子区和CpG岛（CGI）区的不同类型mC分布比例类似，D11叶酸缺乏组小鼠mCG比例增加而mCHH比例下降。与正常组相比，叶酸缺乏组小鼠子宫内膜组织中总 C的平均甲基化水平在D7开始下降，D8下降更为明显，而mC的平均甲基化水平则在D8出现降低；胚胎组织基因组总C的平均甲基化水平在孕10天开始下降，孕11天下降更为明显，而mC的平均甲基化水平在D9-D11均高于正常组，但mCG在叶酸缺乏组的甲基化水平仍有所降低；甲基化水平的差异均集中于CG和mCG。对两组之间的差异甲基化区域统计结果显示，D6、D7和D8子宫内膜组织基因组分别存在666个、646个和785个DMRs；D9、D10和D11胚胎组织基因组分别存在795个、2480个和1602个DMRs。GO分析结果显示，D6-D8差异甲基化区域相关基因主要涉及生物粘附、生物调节、细胞增殖、发育代谢和信号通路功能；D9-D11差异甲基化区域相关基因主要涉及生物调节、细胞过程、发育代谢、应激反应和信号通路功能。Real-time PCR结果显示，两组间存在甲基化差异的基因，其mRNA水平也发生变化。
　　4.叶酸缺乏对PCP信号通路的影响：Real-time PCR、Western blot结果显示，叶酸缺乏组小鼠胚胎组织中Vangl1和Vangl2的mRNA及蛋白水平自D9开始出现下降，并随妊娠进行下调更为明显。免疫共沉淀结果显示，叶酸缺乏的情况下，小鼠胚胎组织中Vangl1蛋白与Dvl1的相互作用被抑制，而与Dvl2、Dvl3的结合未受影响；而Vangl2蛋白与Dvl1、Dvl2、Dvl3的结合均被叶酸缺乏抑制。BSP测序结果显示，叶酸缺乏组小鼠D9胚胎组织中Vangl基因甲基化率较正常组无显著差异。CDS测序结果与NCBI数据库比对发现，正常组小鼠和叶酸缺乏组小鼠 D9-D13胚胎组织中 Vangl基因存在三个 SNP位点，分别是Vangl1基因SNP位点rs36584696、Vangl2基因SNP位点rs48000091和rs31578570。
　　结论：
　　1.叶酸缺乏抑制小鼠子宫内膜基质细胞的蜕膜化进程，同时引起子宫内膜基因组甲基化模式的改变，包括不同类型 mC的分布和平均甲基化水平，从而影响关键基因的表达和功能，这可能是低叶酸水平导致蜕膜化进程受阻的潜在分子机制。母体叶酸摄入不足在妊娠早期即发挥作用，以上数据为调整补充叶酸的时机提供了基础研究证据。
　　2.叶酸缺乏会导致小鼠生殖能力严重受损，胚胎发育停滞，同时改变胚胎基因组的甲基化模式，包括不同类型 mC的分布和甲基化水平，影响发育相关基因的表达。
　　3.叶酸缺乏会抑制PCP信号通路核心基因Vangl基因的表达及功能，其作用机制不依赖于 DNA甲基化，叶酸摄入不足可能不会引起Vangl基因发生突变。基因组甲基化模式的改变，导致发育关键基因的表达和功能异常以及PCP信号通路的抑制，这可能是叶酸缺乏损害胚胎发育的潜在分子机制。

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英汉缩略语名词对照

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英文摘要

第一部分 叶酸缺乏对小鼠子宫内膜蜕膜化的影响及其对基因组甲基化模式的调控

前言

1材料

1.1实验动物

1.2实验试剂

1.3实验仪器

2方法

2.1构建动物模型

2.2小鼠血浆叶酸水平测定

2.3子宫形态观察

2.4组织包埋

2.5 HE染色

2.6总RNA提取

2.7逆转录反应

2.8 Real-time PCR

2.9细胞培养及体外诱导蜕膜化

2.10免疫荧光

2.11简化表观亚硫酸氢盐测序（RRBS）及数据分析

2.12统计分析

3结果

3.1叶酸缺乏小鼠模型构建成功

3.2叶酸缺乏损害妊娠早期子宫内膜功能

3.3叶酸缺乏抑制小鼠子宫内膜蜕膜化

3.4叶酸缺乏抑制原代小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化

3.5叶酸缺乏改变小鼠蜕膜化时期子宫内膜基因组的甲基化模式

3.6差异甲基化区域（DMRs）和GO分析

3.7叶酸缺乏改变蜕膜化相关基因的甲基化水平和表达

4讨论

第二部分 叶酸缺乏对胚胎发育和PCP信号通路的影响及其对基因组甲基化模式的调控

前言

1材料

1.1实验动物

1.2实验试剂和配制

1.3主要仪器

2方法

2.1构建动物模型

2.2血浆叶酸水平测定

2.3繁殖能力评定

2.4简化表观亚硫酸氢盐测序（RRBS）及数据分析

2.5组织总RNA提取

2.6 Real-time PCR

2.7组织蛋白提取

2.8 Western blot

2.9亚硫酸氢盐测序

2.10编码区(CDS)测序

2.11统计分析

3结果

3.1成功构建叶酸缺乏小鼠模型

3.2叶酸缺乏导致小鼠生殖能力下降

3.3叶酸缺乏改变小鼠D9-D11胚胎组织基因组的甲基化模式

3.4差异甲基化区域（DMRs）和GO分析

3.5叶酸缺乏改变发育相关基因的甲基化水平和表达

3.6叶酸缺乏抑制Vangl基因的表达及功能

3.7叶酸缺乏对Vangl基因的作用不依赖于DNA甲基化

3.8叶酸缺乏未诱发Vangl基因发生突变

4讨论

全文总结

参考文献

文献综述:叶酸对妊娠的影响及作用机制

致谢

攻读博士学位期间发表学术论文情况

攻读博士学位期间参加科研项目情况