一种研究基因启动子区DNA甲基化和组蛋白甲基化调控模式的方法

摘要

本发明涉及一种研究基因启动子区DNA甲基化和组蛋白甲基化调控模式的方法，包括以下步骤：确定DNA甲基化对目的基因的调控、确定组蛋白H3K4me2/3对目的基因的调控、确定DNA甲基化和组蛋白H3K4me2/3对目的基因的表达调控；确定何种表观遗传修饰对目的基因起主要调控作用。通过本发明，本方法简单可行，具有可行性，操作简便，研究思路清晰可靠，具有广泛应用性，因DNA甲基化和组蛋白甲基化具有高度保守性，因此在不同物种或不同生物学过程中均能使用该方法研究DNA甲基化和组蛋白甲基化对基因表达的调控模式。

说明书

技术领域

本发明涉及一种研究基因启动子区DNA甲基化和组蛋白甲基化调控模式的方法，属于生物技术领域。

背景技术

DNA甲基化能通过甲基转移酶转移甲基，在不改变DNA序列的情况下，引起染色质结构、DNA稳定性和构象等改变，从而调控基因的特异表达。CpG岛的甲基化因其可抑制转录因子和DNA的结合、抑制转座子等活性，通常被认为是抑制基因表达的因素。而组蛋白作为与DNA结合的碱性蛋白质，其不同位点的甲基化状态影响基因的表达调控。研究表明，组蛋白H3K4me2和H3K4me3修饰位点主要富集在转录起始位点的启动子上激活基因表达，而H3K27me2和H3K27me3则抑制基因表达。因此，在启动子区可能同时存在DNA甲基化和组蛋白甲基化的共同修饰，然而抑制性的DNA甲基化和激活性的H3K4me2/3对基因表达调控的主导作用可能因组织、物种和生物学过程而不同。因此，对DNA甲基化和组蛋白H3K4me2/3如何调控基因表达，仍需进一步挖掘。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有问题，提供一种研究基因启动子区DNA甲基化和组蛋白甲基化调控模式的方法。

本发明的技术方案是：一种研究基因启动子区DNA甲基化和组蛋白甲基化调控模式的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）、确定样本目的基因的启动子，先对目的基因的启动子区进行生物信息学分析，利用http://www.Urogene.Org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi在线网站对目的基因启动子区的CpG岛进行分析，进而通过重亚硫酸盐测序分析不同样本中基因启动子区的DNA甲基化水平；

（2）、在CHIP在线数据库http://cistrome.org/db/#/获得目的样本中H3K4me2/3富集的基因片段，采集目的样本进行组蛋白甲基化H3K4me2/3的CHIP-seq测序实验，分析组蛋白甲基化富集的区域，并通过CHIP-qPCR验证H3K4me2/3在目的基因启动子区的富集；

（3）、在确定目的基因启动子区同时存在DNA甲基化和H3K4me2/3富集后，利用DNA甲基化抑制剂5’aza处理目的基因启动子区后，双荧光素酶和qRT-PCR分别检测目的基因的启动活性和转录水平，确定DNA甲基化对目的基因的表达调控；

（4）、利用组蛋白甲基化酶Mll2/去甲基化酶Lsd1干扰载体分别处理目的基因，双荧光素酶和qRT-PCR分别检测目的基因的启动活性和转录水平，确定H3K4me2/3对目的基因的表达调控；

（5）、为进一步研究DNA甲基化和H3K4me2/3甲基化具体的调控模式，将5’aza分别与组蛋白甲基化酶Mll2/去甲基化酶Lsd1干扰载体共同处理目的基因，双荧光素酶和qRT-PCR分别检测目的基因的启动活性和转录水平；以此确定何种表观遗传修饰对目的基因起主要调控作用。

所述样本为鸡原始生殖细胞PGCs或鸡精原干细胞。

步骤（2）中，通过CHIP-qPCR验证H3K4me2/3在目的基因启动子区的富集，，尤其是在CpG岛区域的富集。

本发明方法先进科学，通过本发明，在确定目的基因的启动子后，首先对目的基因的启动子区进行生物信息学分析，利用http://www.Urogene.Org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi在线网站对目的基因启动子区的CpG岛进行分析，进而通过重亚硫酸盐测序分析不同样本中基因启动子区的DNA甲基化水平。同时在CHIP在线数据库（http://cistrome.org/db/#/）获得目的样本中H3K4me2/3富集的基因片段， 采集目的样本进行组蛋白甲基化H3K4me2/3的CHIP-seq测序实验，分析组蛋白甲基化富集的区域，并通过CHIP-qPCR验证H3K4me2/3在目的基因启动子区（尤其是CpG岛）的富集。在确定目的基因启动子区同时存在DNA甲基化和H3K4me2/3富集后，利用DNA甲基化抑制剂5’aza处理目的基因启动子区后，双荧光素酶和qRT-PCR分别检测目的基因的启动活性和转录水平，确定DNA甲基化对目的基因的表达调控。同时利用组蛋白甲基化酶Mll2/去甲基化酶Lsd1干扰载体分别处理目的基因，双荧光素酶和qRT-PCR分别检测目的基因的启动活性和转录水平，确定H3K4me2/3对目的基因的表达调控。为进一步研究DNA甲基化和H3K4me2/3甲基化具体的调控模式，将5’aza分别与组蛋白甲基化酶Mll2/去甲基化酶Lsd1干扰载体共同处理目的基因，双荧光素酶和qRT-PCR分别检测目的基因的启动活性和转录水平。以此确定何种表观遗传修饰对目的基因起主要调控作用。

基因的表达调控从多个层次上均受多种因素的影响，包括转录水平、mRNA水平和翻译水平等。基因转录水平上的调控主要是通过转录因子和染色质构象改变实现的。众所周知，转录因子可与RNA聚合酶II共同组成转录起始复合体，参与转录起始过程。而这一过程通常还需要表观遗传修饰的参与。DNA甲基化作为抑制基因表达的表观遗传因素，通常通过在CpG的甲基化对基因表达起调控作用。然而转录过程中存在的表观遗传修饰并不只有DNA甲基化。组蛋白作为核小体的核心，其不同位点发生的甲基化修饰对基因表达同样具有调控。然而，CpG岛若同时出现DNA甲基化和激活型的组蛋白甲基化（如H3K4me2/3）时，二者对基因的表达调控模式尚未有研究。本方法结合生物信息学分析和CHIP-seq等实验，将系统地研究基因启动子区双重组蛋白修饰的调控模式，为探索基因表达调控机制提供理论依据和操作方法。

有益效果：

本方法简单可行，具有可行性，操作简便，研究思路清晰可靠，具有广泛应用性，因DNA甲基化和组蛋白甲基化具有高度保守性，因此在不同物种或不同生物学过程中均能使用该方法研究DNA甲基化和组蛋白甲基化对基因表达的调控模式。

具体实施方法

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。但本发明的保护范围并不仅限于此：

1、确定DNA甲基化对目的基因的调控；

本方法以鸡原始生殖细胞（PGCs）样本为例，研究该样本中目的基因启动子区DNA甲基化和组蛋白H3K4me2/3的调控模式。首先利用在线网站

http://www.Urogene.Org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi对获得的基因启动子区进行CpG岛分析，确定DNA甲基化富集的区域。接着根据该区域设计扩增引物；提取PGC细胞的基因组，利用重亚硫酸盐试剂盒（天根）进行转化、纯化，并以此DNA为模版，进行DNA甲基化片段扩增。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳及切胶回收，获得目的片段，进行TA克隆并转化感受态细胞，挑取10个阳性菌落。利用QUMA在线网站对测序结果和DNA甲基化片段进行比对，确定PGCs细胞中目的基因启动子区DNA甲基化水平。将目的基因的双荧光素酶报告载体转染鸡成纤维细胞系/293T细胞，用DNA甲基化酶抑制剂5’aza对其进行处理，培养48h后，收集细胞进行双荧光素酶报告检测。用DNA甲基化酶抑制剂5’aza对PGCs、鸡成纤维细胞系/293T细胞进行处理，培养48h后，收集细胞，提取RNA,反转录为cDNA后进行qRT-PCR检测。确定DNA甲基化对目的基因的转录调控。

2、确定组蛋白H3K4me2/3对目的基因的调控；

在CHIP在线数据库（http://cistrome.org/db/#/）获得目的样本（如鸡PGCs）中H3K4me2/3富集的基因片段。同时收集鸡PGCs，进行H3K4me2/3的CHIP-seq测序，获得H3K4me2/3富集的基因和序列，查找目的基因的存在同时查找CpG岛位置是否存在H3K4me2/3富集。根据片段序列设计CHIP-qPCR引物，在PGCs中验证测序结果。确定目的基因启动子区存在H3K4me2/3的富集。利用Mll2/Lsd1干扰载体和目的基因双荧光报告载体同时转染鸡成纤维细胞系/293T细胞，培养48h后，收集细胞进行双荧光素酶报告检测。同时用Mll2/Lsd1干扰载体转染PGCs、鸡成纤维细胞系/293T细胞，培养48h后，收集细胞，提取RNA，反转录为cDNA，qRT-PCR检测目的基因表达，确定组蛋白H3K4me2/3对目的基因的调控。

3、确定DNA甲基化和组蛋白H3K4me2/3对目的基因的表达调控；

在分别确定DNA甲基化和H3K4me2/3对基因的表达调控后，为了验证二者同时存在的情况下对基因表达的调控模式。利用Mll2/Lsd1干扰载体和目的基因双荧光报告载体同时转染鸡成纤维细胞系/293T细胞，在此基础上进行DNA甲基化酶抑制剂5’aza处理，培养48h后，收集细胞进行双荧光素酶报告检测。用Mll2/Lsd1干扰载体转染PGCs、鸡成纤维细胞系/293T细胞，同时进行5’aza处理，培养48h后，收集细胞，提取RNA，反转录为cDNA，qRT-PCR检测目的基因表达，确定DNA甲基化和组蛋白H3K4me2/3对目的基因的调控模式。

以上实施例是以鸡原始生殖细胞（PGCs）为样本，也可以以精原干细胞为样本，操作步骤与鸡原始生殖细胞（PGCs）为样本的操作步骤相同。