黑色素瘤全基因组DNA甲基化与组蛋白甲基化异常谱式的研究

摘要

第一部分、黑色素瘤细胞全基因组DNA甲基化谱的改变及其特征
　　 目的：研究黑色素瘤全基因组DNA甲基化谱的改变及其特征。
　　 方法：抽提黑色素瘤细胞系SK-MEL-28、LOXIMVI和正常黑素细胞HEMn及HEMa的基因组DNA，用限制性内切酶SmaI和XmaI依次充分消化，然后对得到的DNA片段进行文库构建，利用第二代测序技术获得文库中DNA片段的末端序列信息，通过计算出每一个CpG位点所对应的SmaI和XmaI切割末端的数量比，从而反映出该CpG位点的甲基化程度。这一方法称为“基于限制性内切酶原理的DNA甲基化数字化分析(DREAM)”。通过与正常黑素细胞比较，分析黑色素瘤细胞DNA甲基化谱的改变及其特点。
　　 结果：黑色素瘤中启动子区域以外存在大量非CpG岛位点的异常低甲基化，而全基因组范围内存在部分CpG岛的异常高甲基化。黑色素瘤基因启动子区域CpG岛的甲基化状态与基因表达水平呈负相关(在SK-MEL-28和LOXIMVI中的Spearman相关系数分别为-0.39、-0.57，p值均小于0.001)。正常黑素细胞中启动子CpG岛处于甲基化状态的基因比处于非甲基化的基因更倾向于在黑色素瘤中发生异常高甲基化(p<0.001)。
　　 结论：黑色素瘤基因组存在整体性低甲基化和广泛的CpG岛高甲基化改变。正常黑素细胞中启动子CpG岛的甲基化状态决定其在黑色素瘤中发生异常高甲基化的倾向。
　　 第二部分、黑色素瘤细胞全基因组组蛋白甲基化谱式的异常及其特征
　　 目的：研究黑色素瘤全基因组范围组蛋白H3K4me3和H3K27me3谱式的改变及其特征。
　　 方法：以黑色素瘤细胞系SK-MEL-28、LOXIMVI和正常黑素细胞HEMn及HEMa为研究对象，采用针对H3K4me3和H3K27me3的特异性抗体进行染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)实验，以抗H3抗体作为对照。用所得高通量数据对黑色素瘤细胞系与正常黑素细胞的H3K4me3/H3K27me3修饰谱进行分析比较。
　　 结果：H3K4me3和H3K27me3在全基因组的分布及其对基因表达的影响不同。H3K4me3主要集中在基因启动子区域，与基因的活性表达相关(p<0.001)，而H3K27me3倾向于覆盖整个基因，与基因表达抑制相关(p<0.001)。正常黑素细胞中具有H3K4me3和H3K27me3标记的二价修饰基因，约90％在黑色素瘤中存在H3K4me3或H3K27me3标记的缺失；而H3K27me3单独标记的基因约70％在黑色素瘤中发生H3K27me3标记的缺失。相反地，正常黑素细胞中H3K4me3单独标记的基因约70％在黑色素瘤中仍维持H3K4me3单独标记状态，仅30％或更少的比例发生H3K4me3标记的缺失。
　　 结论：黑色素瘤存在全基因组范围H3K4me3和H3K27me3修饰谱的显著改变。
　　 第三部分、黑色素瘤DNA甲基化与组蛋白甲基化修饰状态的关系
　　 目的：研究黑色素瘤DNA甲基化与组蛋白H3K4me3和H3K27me3的关系。
　　 方法：以黑色素瘤细胞系SK-MEL-28、LOXIMVI和正常黑素细胞HEMn及HEMa为研究对象，对全基因组范围DNA甲基化谱与组蛋白H3K4me3和H3K27me3修饰谱的数据进行关联与分析。
　　 结果：在同一细胞中，启动子区域CpG岛处于非甲基化时比处于甲基化状态时结合H3K4me3的比例更高(p<0.001)。正常黑素细胞中具有H3K4me3组蛋白标记的基因在黑色素瘤中发生启动子区域CpG岛异常高甲基化的比例显著低于具有H3K27me3组蛋白标记或缺失H3K4me3组蛋白标记的基因(p<0.001)。黑色素瘤中发生异常高甲基化的基因约17％～21％在正常黑素细胞中处于H3K4me3标记状态。
　　 结论：组蛋白H3K4me3/H3K27me3修饰与DNA甲基化及其异常改变密切相关，二者共同参与黑色素瘤的发生过程。