PLCD1通过KIF3A调控ERK1/2/β-catenin/MMP7信号通路抑制人乳腺癌细胞迁移侵袭研究

摘要

目的：
　　1.检测PLCD1对人乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响；
　　2.分析PLCD1对ERK/β-catenin/MMP7信号通路的调节作用；
　　3.探讨PLCD1调控ERK/β-catenin/MMP7信号通路的潜在机制。
　　方法：
　　1.使用在线软件Oncomine、Kaplan-Meier Plotter、BioGRID3.4、bc-GenExMiner，分析PLCD1和KIF3A在人乳腺癌中的表达情况、PLCD1在人乳腺癌中的预后价值，以及PLCD1与KIF3A的相关性；
　　2.运用Real-time PCR检测PLCD1在人乳腺癌组织及配对癌旁组织中的表达情况；采用RT-PCR检测PLCD1在人乳腺癌细胞株中的表达情况；
　　3.运用PLCD1质粒过表达PLCD1；运用siPLCD1和siKIF3A分别敲减 PLCD1和 KIF3A的表达；运用 U0126特异性抑制磷酸化ERK1/2的表达；
　　4.运用划痕愈合实验和Transwell小室实验检测人乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力；
　　5.运用Western blot检测 PLCD1、KIF3A、ERK1/2、GSK-3β、β-catenin、MMP7等分子的表达；
　　6.运用IHC检测PLCD1、ERK1/2、β-catenin、MMP7的表达；
　　7.运用ELISA检测MMP7蛋白在细胞培养上清液中的表达情况。
　　结果：
　　1.与癌旁组织相比，PLCD1在人乳腺癌组织中表达相对较低；与乳腺正常组织相比，PLCD1在人乳腺癌组织中的表达较低；与淋巴结转移阴性的乳腺癌相比，PLCD1在淋巴结转移阳性的乳腺癌中表达较低；与低表达PLCD1的乳腺癌患者相比，高表达PLCD1的乳腺癌患者的无远处转移生存期和总生存期较长；
　　2.PLCD1在人正常乳腺组织以及BT-549、SK-BR-3人乳腺癌细胞株中正常表达，在T47D中表达较弱，在MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7以及ZR-75-1细胞株中未见表达；
　　3.在MDA-MB-231细胞中，对照组细胞和PLCD1过表达组细胞24小时迁移的距离分别为28.8±1.0和21.06±1.1(P＜0.01)，细胞迁移数分别为274±23和113±16(P＜0.01)，侵袭数分别为137±12和62±10(P＜0.01)；在 MCF-7细胞中，对照组细胞和 PLCD1过表达组细胞48小时迁移的距离分别为17.6±0.9和9.55±1.4(P＜0.01)；在BT-549细胞中，空白对照组、阴性对照组和两个PLCD1敲减组细胞24小时迁移的距离分别为18.8±1.2、17.9±1.5、29.6±2.4和29.6±2.5(P＜0.01)，细胞迁移数分别为165±9、166±12、323±27和286±31(P＜0.01)，侵袭数分别为71±4、75±12、123±12和107±20(P＜0.01)；
　　4.在MDA-MB-231和 MCF-7细胞中，与对照组相比，过表达PLCD1的细胞中pERK1/2、pGSK-3β、active-β-catenin和MMP7的蛋白水平较低，培养上清液中MMP7水平较低；在BT-549细胞中，与对照组相比，敲减内源性PLCD1的细胞中 pERK1/2、pGSK-3β、active-β-catenin和MMP7的蛋白水平较高，培养上清液中MMP7水平较高；在裸鼠成瘤模型中，IHC检测显示过表达PLCD1的瘤体中，pERK1/2、active-β-catenin和MMP7的表达水平较低；在MDA-MB-231和MCF-7细胞中，特异性抑制pERK1/2表达，pGSK-3β、active-β-catenin和MMP7的表达较前下降；
　　5.与乳腺正常组织相比，KIF3A在人乳腺癌组织中的表达较高，与PLCD1表达有相关性(r=-0.09,p＜0.0001,n=5164)；在BT-549细胞中，敲减PLCD1显示KIF3A的表达上调，敲减KIF3A后PLCD1表达未见变化；
　　6.在MDA-MB-231细胞中，空白对照组、阴性对照组和两个KIF3A敲减组细胞24小时迁移的距离分别为31.0±1.2、31.2±1.1、17.9±0.9和17.2±0.5(P＜0.01)，细胞迁移数分别为167±9、164±9、76±11和95±12(P＜0.01)，侵袭数分别为125±12、124±9、67±8和88±8(P＜0.01)；在 BT-549细胞中，空白对照组、阴性对照组和两个 KIF3A敲减组细胞24小时迁移的距离分别为27.3±1.0、26.9±0.8、8.0±0.9和13.6±1.3(P＜0.01)，细胞迁移数分别为269±15、260±15、122±16和119±16(P＜0.01)，侵袭数分别为174±10、173±5、76±6和76±8(p＜0.01)；
　　7.在MDA-MB-231和BT-549细胞中，敲减KIF3A时，pERK1/2、pGSK-3β、active-β-catenin和MMP7蛋白水平下降，细胞培养上清液中的MMP7蛋白含量下降；
　　8.同时敲减PLCD1和KIF3A时，划痕愈合实验结果显示BT-549细胞中五组细胞16小时迁移的距离分别为13.6±1.3、13.4±1.0，23.7±0.8、23.6±1.2和17.3±1.2(P＜0.01)，细胞迁移数分别为153±13、155±7、227±9、230±17和145±13(P＜0.01)，侵袭数分别为81±7、80±5、163±11、168±12和85±6(P＜0.01)；
　　9.在BT-549细胞中同时敲减PLCD1和KIF3A时，与单独敲减PLCD1相比，pERK1/2、pGSK-3β、active-β-catenin和MMP7的表达减弱，细胞培养上清液中MMP7蛋白含量下降。
　　结论：
　　1.PLCD1能够抑制人乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力；
　　2.PLCD1通过下调KIF3A调控ERK1/2/β-catenin/MMP7信号通路发挥抑癌基因作用。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分 PLCD1在人乳腺癌中的表达及人乳腺癌细胞中的功能研究

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第二部分 PLCD1调控ERK1/2/GSK-3β/β-catenin信号通路抑制MMP7表达

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第三部分KIF3A介导PLCD1的抑癌作用

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

结论

文献综述:β-catenin在乳腺癌中的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的文章