DKK1通过β-catenin/MMP7信号通路促进肝癌细胞迁移和侵袭

摘要

实验背景:
　　肝细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内，其致死率在肿瘤相关疾病中排名第三位。近年来虽然早期诊断，以及放疗、化疗和手术治疗的联合使用使肝癌的治疗有了一定的提高，然而，到目前为止，肝癌患者的预后仍然不容乐观。最近有几篇报道表明DKK1的高表达和肝癌的发展密切相关。然而，DKK1在肝癌中的生物学功能及其分子机制仍不清楚。
　　实验目的:
　　本文以肝癌细胞和肝癌组织为研究对象，以期探讨DKK1在肝癌中的生物学功能及其潜在的作用机制。
　　实验方法:
　　采用RT-PCR和Western blotting实验检测正常肝细胞(QSG-7701)和四种肝癌细胞(Hep G2，SMMC-7721，HuH-7和BEL-7402)中DKK1 mRNA和蛋白的表达。采用免疫组化法检测肝癌组织中DKK1和β-catenin的表达。采用MTT和克隆形成实验检测DKK1对肝癌细胞增殖的影响。采用划痕和Transwell实验检测细胞的侵袭和迁移能力。使用GSK3β抑制剂LiCl和β-catenin抑制剂IWP-2来进一步确认β-catenin在DKK1诱导的肝癌细胞侵袭和迁移中的作用。应用RT-PCR检测肝癌细胞中β-catenin，MMP7，以及LRP6 mRNA的表达，采用Western blotting检测β-catenin，MMP7，LRP6，GSK3β和c-Myc等蛋白的表达。
　　实验结果:
　　1、与正常的肝细胞QSG-7701相比，DKK1的mRNA和蛋白水平在肝癌细胞系HuH-7，SMMC-7721和BEL-7402中明显高表达。值得注意的是:DKK1的mRNA和蛋白水平在BEL-7402细胞中表达最高，在Hep G2细胞中表达最低。
　　2、当DKK1表达上调或者下调，肝癌细胞的增殖率并不改变。克隆形成实验结果显示:DKK1表达上调或者下调时只能微弱的增加或减少克隆数目，但与对照组相比并没有显著性差异。
　　3、DKK1高表达能明显促进肝癌细胞的伤口愈合率，反之，当DKK1低表达时能显著降低肝癌细胞的伤口愈合率。Transwell实验结果显示:与对照组相比，DKK1稳定高表达的细胞表现出更高的侵袭和迁移率;稳定转染DKK1 shRNA的肝癌细胞表现出更低的侵袭和迁移能力。与这些结果相一致的是，与健侧正常的肝组织相比，DKK1在肝癌组织中明显高表达;而且，与非转移性的肝癌组织相比较，DKK1在转移性的肝癌组织中表达更高。
　　4、免疫组化结果表明:在肝癌组织中，DKK1的表达和β-catenin表达成正相关。而且，DKK1表达上调不仅能明显促进Hep G2细胞中β-catenin的mRNA和蛋白水平，而且能明显增加Hep G2细胞中β-catenin在细胞浆/细胞核的累积，以及增强具有野生型TCF结合位点的荧光素酶活性。反之，DKK1表达下调能明显减少BEL-7402细胞中β-catenin的mRNA和蛋白表达，以及降低具有野生型TCF结合位点的荧光素酶活性。
　　5、使用β-catenin抑制剂IWP-2处理后，DKK1诱导的肝癌细胞的侵袭和迁移被明显降低。在稳定转染DKK1 shRNA的肝癌细胞中，上调β-catenin的表达能部分恢复DKK1 shRNA对β-catenin的转录和肝癌细胞的侵袭的抑制作用。同样，当使用GSK3β抑制剂LiCl处理后，DKK1 shRNA对肝癌细胞的侵袭和迁移能力的抑制作用也被显著地解除。
　　6、RT-PCR结果表明:尽管DKK1表达上调或者下调能显著改变β-catenin的mRNA水平，但并不影响LRP6细胞内域和细胞外域的转录。Western blotting结果同样表明:DKK1表达上调或下调不会影响LRP6细胞内域和GSK3β的蛋白表达。然而，DKK1表达上调或者下调能明显增加或者减少β-catenin和其下游靶点c-Myc的蛋白表达水平。进一步研究发现:β-catenin抑制剂IWP-2能明显抑制β-catenin的蛋白表达，而在稳定转染DKK1 shRNA的肝癌BEL-7402细胞中，GSK3β抑制剂LiCl能部分恢复DKK1 shRNA对β-catenin的蛋白表达的抑制作用。
　　7、DKK1表达上调能显著增加Hep G2细胞中β-catenin的mRNA和蛋白水平，反之，当用shRNA沉默DKK1后，肝癌细胞BEL-7402中β-catenin的mRNA和蛋白水平显著地降低。而且，β-catenin抑制剂IWP-2能够剂量依赖性的降低肝癌细胞中MMP7蛋白的表达。与对照组相比，转染MMP7质粒的Hep G2细胞表现出更高的侵袭力。
　　实验结论:
　　1、DKK1在肝癌细胞中是高表达的。
　　2、DKK1对肝癌细胞的增殖没有影响。
　　3、DKK1显著促进肝癌细胞的迁移和侵袭，而且，DKK1在肝癌组织中明显高表达;此外，与非转移性的肝癌组织相比较，DKK1在转移性的肿瘤组织中表达更高。
　　4、利用功能获得和功能丧失实验，我们证实DKK1是通过一种非经典的Wnt信号通路来促进肝癌细胞中β-catenin的表达，继而诱导肝癌细胞的迁移和侵袭。
　　5、MMP7是β-catenin信号通路下游的一个重要靶点，它在DKK1介导的肝癌细胞侵袭中扮演着重要角色。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

第二章 试剂、材料和仪器

2．1 主要试剂及材料

2．1．1 细胞培养试剂

2．1．2 细菌培养试剂

2．1．3 RT-PCR所用主要试剂

2．1．4 Western blot主要试剂

2．1．5 其他主要试剂及材料

2．2 标本收集

2．3 细胞株

2．4 菌株

2．5 质粒

2．6 引物

2．7 试剂及主要溶液的配制

2．7．1 细胞培养试剂

2．7．2 细菌培养试剂

2．7．3 琼脂糖凝胶电泳试剂

2．7．4 Western blot所用试剂的配制

2．7．5 免疫组化所用试剂的配制

2．8 主要仪器

第三章 实验方法

3．1 细胞株的培养

3．2 载体的构建

3．3 质粒DNA的转化及提取

3．4 细胞转染实验

3．5 TCF荧光素酶报告分析

3．6 细胞迁移实验

3．7 细胞侵袭实验

3．8 RT-PCR

3．9 蛋白提取及浓度测定

3．10 SDS-PAGE具体步骤

3．11 细胞生长曲线的测定

3．12 细胞克隆形成分析

3．13 划痕实验

3．14 免疫荧光实验

3．15 免疫组化实验

3．16 统计学分析

第四章 实验结果

4．1 DKK1在肝癌细胞中是高表达的

4．2 DKK1对肝癌细胞的增殖和克隆形成没有影响

4．3 DKK1调控肝癌细胞的迁移和侵袭

4．4 DKK1促进β-catenin的表达

4．5 DKK1通过诱导β-catenin来促进肝癌细胞的迁移和侵袭

4．6 MMP7是DKK1／β-catenin信号通路下游的一个重要靶点

结论

讨论

参考文献

附录

致谢

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